流動分析儀同時測定土壤和植物全氮含量方法的改進

李朝英，鄭 路，2*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實驗中心，廣西 憑祥 532600；2.廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，廣西 憑祥 532600)

【研究意義】準(zhǔn)確測定土壤和植物的養(yǎng)分含量有利于合理施肥及保持和提高土壤肥力[1-5]。氮是植物生長所需的大量元素之一，土壤中氮的存在對植物營養(yǎng)具有重要作用。測定土壤和植物全氮含量的傳統(tǒng)方法通常先以凱式消煮法處理樣品，使全氮轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，再采用半微量凱式定氮法或擴散法檢測全氮含量[6-7]。半微量凱式定氮法或擴散法均需用高濃度氫氧化鈉將消煮液中的硫酸銨堿化，蒸餾出的氨經(jīng)硼酸吸收，由標(biāo)準(zhǔn)酸滴定測取全氮含量。由于半微量凱式定氮法操作繁瑣費時，效率低，易受到人為因素影響而造成一定誤差，不適用于對批量樣品全氮含量的測定。擴散法操作簡單，尤其是具皿塞的塑料擴散皿密封效果良好，檢測準(zhǔn)確，但因蒸餾、擴散及吸收過程需在恒溫條件放置24 h，檢測周期長，不能快速完成全氮含量測定[8-9]。流動分析儀自動化程度高，能進行自動進樣、顯色檢測及數(shù)據(jù)處理，可大幅度降低操作人員工作強度，提高檢測效率，且試劑消耗量小，檢測準(zhǔn)確、經(jīng)濟，是滿足大批量樣品全氮含量快速測定需求的理想方法[10-11]。但土壤的全氮含量通常在0～30.0 mg/L，而植物的全氮含量高達(dá)150.0 mg/L，是土壤全氮含量的5倍或以上，超出流動分析儀測定范圍，兩類樣品難以同時使用流動分析儀進行全氮含量測定，不利于提高檢測效率。因此，改進流動分析儀同時測定土壤和植物樣品全氮含量的方法，對準(zhǔn)確快速測定土壤和植物全氮含量具有重要意義。【前人研究進展】流動分析儀檢測全氮含量原理是基于Bertfelot反應(yīng)、顯色條件為堿性(pH 12.8～13.1)條件下，消煮液中銨態(tài)氮與水楊酸鈉和次氯酸鈉生成5-氨基水楊酸，經(jīng)氧化和絡(luò)合后生成綠色絡(luò)合物，該物質(zhì)最大吸收波長為660 nm[12-13]。凱式消煮法所用硫酸量通常為5.0 mL，消煮液洗出并稀釋至100.0 mL后酸度較高，氫離子濃度約為1.8 mol/L，以流動分析儀檢測全氮含量時需在緩沖液中加入一定量的氫氧化鈉中和消煮液中多余的酸，才能滿足充分顯色的條件[12]。張英利等[13]研究提出，緩沖液中加入氫氧化鈉量偏高會增加試劑成本，加速流動分析儀透析膜的損耗，且易造成測定漂移，增加誤差，因此測定土壤全氮含量時以加入25.1 g/L氫氧化鈉為宜，測定植物全氮含量以加入15.2 g/L氫氧化鈉為佳。也有研究提出，在測定植物全氮含量所用緩沖液中加入32.0 g/L氫氧化鈉的效果較佳[14]。現(xiàn)有研究對土壤和植物全氮含量的測定多是分開進行，且對氮含量較高植物全氮含量的測定是將其消煮液進行高倍數(shù)稀釋后再使用流動分析儀測定，費工費時[13-15]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于凱式消煮法的研究主要圍繞不同催化劑和氧化劑對全氮含量測定的影響進行[16-17]，針對硫酸加入量對樣品全氮含量測定影響、以不同酸度消煮液建立流動分析儀測定全氮含量方法及使用流動分析儀同時測定土壤和植物樣品全氮含量方法的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對凱式消煮法所用硫酸量進行優(yōu)化，建立不同酸度消解液樣品的全氮含量檢測方法，為使用流動分析儀準(zhǔn)確高效地同時檢測土壤和植物全氮含量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 2018年8月于廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站設(shè)置在青山實驗場人工林的5個樣地取土壤樣品10個，編號為樣6～樣15，格木(ErythrophleumfordiiOliv.) 葉樣1個(簡稱plant 1)，馬尾松(PinusmassonianaLamb.)葉樣1個(簡稱plant 2)。將土壤樣地每個樣點2個剖面層(即0～20和20～40 cm剖面層)的土樣風(fēng)干后碾壓過10目篩，以四分法取對角土樣，再碾壓處理過60目篩，密封于聚丙烯袋中。2個植物樣品經(jīng)65 ℃烘干后，粉碎過40目篩，裝袋標(biāo)識。使用前65 ℃烘干至恒重，置于干燥器中冷卻備用。取標(biāo)準(zhǔn)土樣S1[GBW07458(ASA-7)，氮含量(1.62±0.07)g/kg]和標(biāo)準(zhǔn)土樣S2[GBW07461(ASA-10)，氮含量(1.09±0.07)g/kg]及實驗室內(nèi)標(biāo)土樣S3[氮含量均值為(0.81±0.03)g/kg]備用。

1.1.2 儀器設(shè)備 主要儀器設(shè)備有電子分析天平(萬分之一)、流動分析儀、恒溫箱、石墨消解爐和塑料擴散皿。

1.1.3 試劑 1000.0 mg/L銨標(biāo)(0.4714 g硫酸銨溶于水中，定容100.0 mL)，98 %濃硫酸，催化劑(硫酸鉀∶硫酸銅按質(zhì)量比9∶1混合均勻)，濃鹽酸，硼酸指示劑，丙三醇，氫氧化鈉，Brij35試劑，緩沖液(35.8 g磷酸氫二鈉，50.0 g酒石酸銻鉀，1.5 mL Brij35試劑及一定量氫氧化鈉溶解，定容1.0 L)，水楊酸鈉溶液(8.0 g水楊酸鈉、0.2 g硝普鈉溶于水中，定容200.0 mL)，次氯酸鈉溶液(1.0 mL 10 %次氯酸鈉溶液溶于水中，定容100.0 mL)，沖洗水(1.0 L水中加入1.5 mL Brij35試劑)。以上試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品消解 稱取土壤樣品S1、S2和S3各0.4000 g、植物樣品plant 1和plant 2各0.0500 g分別放入消解管中，以該5個樣品為1組，共設(shè)9組，各組各樣品加入1.8 g催化劑后，其中的3組各樣品加入3.0 mL硫酸，3組樣品加入4.0 mL硫酸，3組樣品加入5.0 mL硫酸，搖勻后置于石墨爐，400 ℃消解120 min。冷卻后的消解液清洗入50.0 mL比色管，用水定容后搖勻備用。

1.2.2 擴散法 采用擴散法測定土壤和植物樣品的全氮含量，并將測定結(jié)果與流動分析儀的測定結(jié)果進行相關(guān)性分析。抽取9組各樣品消解液各5.0 mL加入擴散皿外室一側(cè)，內(nèi)室加入硼酸指示劑2.5 mL，擴散皿沿及蓋塞外側(cè)均勻涂抹丙三醇，將蓋塞放在擴散皿口上，與皿口留有縫隙，縫隙下方為加入氫氧化鈉的外室?？焖儆煽p隙處將10.00 mol/L氫氧化鈉10.0 mL加入外室，立即封蓋后，旋轉(zhuǎn)蓋塞，排出丙三醇中的空氣。水平轉(zhuǎn)動擴散皿，使消解液與氫氧化鈉混合。擴散皿置于40 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，以0.01 mol/L鹽酸滴定至紫紅色?？瞻淄喜僮?。

圖1 流動分析儀管路

1.2.3 流動分析儀法 按圖1管路圖設(shè)置試驗的管路。管1～10依次為清洗液、空氣、緩沖液、進樣管、空氣、緩沖液、水、水楊酸鈉溶液、次氯酸鈉溶液和沖洗水。測定3.0、4.0和5.0 mL硫酸消煮液時，所用緩沖液中氫氧化鈉濃度分別為19.0、25.0和30.5 g/L。為了減少或避免管路吸附試劑引起反應(yīng)干擾，低濃度進樣管所插入的水含有1.5 mL/L Brij35(在pH>7的顯色條件下，Brij35呈無色狀態(tài)，對顯色反應(yīng)無影響)。

檢測參數(shù)及方法。進樣速率50個/h，進樣與清洗時間比為2∶1(進樣時間為48 s，清洗時間24 s)。儀器默認(rèn)設(shè)置基線和漂移校正，自動基線參比為5 %。比色濾光片為660 nm。土壤全氮含量通常在0～30.0 mg/L，在流動分析儀測定全氮的線性范圍；植物全氮含量通常為150.0 mg/L，常規(guī)稱量量為0.2500 g，因此將植物樣品稱量量調(diào)整為0.0500 g，其氮含量控制在流動分析儀測定全氮的線性范圍內(nèi)，選用高濃度進樣管。

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:抽取1000.0 mg/L銨標(biāo)準(zhǔn)液0、0.20、0.30、0.40、0.50和0.75 mL，共抽取3組，分別用3.0、4.0和5.0 mL硫酸消煮空白液定容至25.0 mL，配得濃度為0、8.0、12.0、16.0、20.0和30.0 mg/L的3組標(biāo)液，分別建立3.0、4.0和5.0 mL硫酸消煮液全氮標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.9888x+0.2339(R2=0.9996)、y=0.996x+0.1237(R2=0.9999)和y=0.978x+0.4463(R2=0.9996)。

流動分析儀法準(zhǔn)確性檢驗:稱取土壤樣品S1和S3各0.4000 g、植物樣品plant 1和plant 2各0.0500 g分別放入消解管中，以該4個樣品為一組，共設(shè)3組，各樣品均加入3.0 mL硫酸、1.8 g催化劑，0.25 mL 1000.0 mg/L銨標(biāo)準(zhǔn)液，搖勻后置于石墨爐，按1.2.1的方法消解樣品(每個樣品加標(biāo)量為5.0 mg/L)。消解液按前述的方法檢測后，計算全氮回收率。全氮回收率(%)=(檢測氮濃度-樣品氮濃度)/加標(biāo)氮濃度×100。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行統(tǒng)計和繪圖，并對成對雙樣本均值進行t檢驗，使用回歸進行相關(guān)性分析；以SPASS 19.0進行單因素(ANOVA)方差分析。

表1 不同硫酸量消解測定的土壤和植物樣品全氮含量比較

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸不同加入量所測全氮含量的比較

由表1可知，使用流動分析儀測得3.0、4.0和5.0 mL硫酸消煮液的全氮含量雖存在差異，但變異系數(shù)(c.v.)均小于5.10 %，可見流動分析儀測定全氮含量的精密度良好。經(jīng)方差分析，3種硫酸加入量土壤和植物樣品消煮液的全氮含量間無顯著差異(P>0.05)。說明3.0和4.0 mL硫酸加入量與5.0 mL硫酸加入量均能充分將土壤和植物樣品的全氮充分轉(zhuǎn)化為硫酸銨，消煮效果一致，即3.0和4.0 mL硫酸加入量對土壤和植物樣品全氮消煮效果無負(fù)面影響，也表明減少植物稱量量使其氮含量控制在30.0 mg/L內(nèi)，可與土壤一起使用流動分析儀同時測定全氮含量。

使用流動分析儀檢測3.0、4.0和5.0 mL硫酸消煮液全氮含量時緩沖液中的氫氧化鈉濃度分別為19.0、25.0和30.5 g/L，即消煮硫酸量與緩沖液的氫氧化鈉濃度比分別為3.0∶19.0、4.0∶25.0和5.0∶30.5，三者的比值(分別為0.158、0.160和0.164)相近，說明流動分析儀測定不同硫酸量消煮液精密度良好，也表明以上酸堿比條件下，各消煮液的顯色反應(yīng)條件充分，檢測準(zhǔn)確。由于加入3.0 mL硫酸量較常規(guī)凱氏消煮法的硫酸用量(5.0 mL)降低40.0 %，緩沖液中氫氧化鈉濃度隨之降低37.7 %，即試劑用量減少，故凱氏消煮法的硫酸加入量可優(yōu)選3.0 mL。

2.2 流動分析儀法的準(zhǔn)確性檢驗結(jié)果

由表2可知，在加標(biāo)量為5.0 mg/L條件下，4個樣品氮含量的平均加標(biāo)回收率在96.40 %～102.07 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.34 %～1.52 %，說明測定值與真實值較接近，流動分析儀測定全氮含量的準(zhǔn)確性較高[8-11]。

2.3 流動分析儀法的精密度檢驗結(jié)果

由表3可知，4個樣品的同一消解液重復(fù)測定3次，所測結(jié)果的c.v.均小于3.00 %，說明流動分析儀法重復(fù)測定的全氮含量離散度較小，精密度良好[8-11]。

2.4 流動分析儀法與擴散法檢測結(jié)果的比較

由表4可知，流動分析儀法與擴散法測得的全氮含量均值分別為12.5796和12.4273 mg/L，經(jīng)t檢驗，P=0.3706>0.05，即二者無顯著差異。流動分析儀法與擴散法測得全氮含量的回歸直線y=1.0747x-0.7762，R=0.9957(n=15，P>0.05)，2種方法測定的全氮含量呈顯著線性相關(guān)(圖2)。說明2種方法測定的全氮含量趨于一致，均適用于氮含量的測定。

表2 流動分析儀加標(biāo)回收試驗結(jié)果

表3 流動分析儀法重復(fù)性試驗結(jié)果

表4 2種全氮含量檢測方法測得全氮含量的t檢驗結(jié)果

圖2 2種全氮含量檢測方法所測氮含量的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討 論

本研究中，以3.0、4.0和5.0 mL硫酸加入量消煮土壤和植物樣品測得的全氮含量無顯著差異，說明3.0～5.0 mL硫酸加入量均能將土壤和植物樣品充分消解，且對消解液全氮含量的測定無負(fù)面影響。以往測定氮含量的凱氏消煮法多為加入5.0 mL硫酸[9-10，12，18]，本研究提出加入3.0 mL硫酸消煮土壤和植物樣品，使用流動分析儀測定全氮含量，結(jié)果硫酸和氫氧化鈉的用量均可明顯減少，節(jié)約了試劑，有利于減少測定漂移，因此可優(yōu)選凱氏消煮法硫酸加入量為3.0 mL。值得注意的是，硫酸在消煮過程與樣品發(fā)生的氧化反應(yīng)會造成硫酸部分損失[19]，建議加入3.0 mL硫酸消煮時，土壤稱量量控制在0.5000 g左右。本研究通過降低植物稱量量，將植物消煮液的氮含量控制在儀器量程范圍內(nèi)，使土壤與植物消煮液的酸度一致，以滿足流動分析儀同時測定其全氮含量的條件，檢測效率可較分別測定兩種樣品全氮含量的方法提高1倍[13]。

流動分析儀法的檢測原理是基于Bertfelot反應(yīng)，在堿性條件下顯色，因此，緩沖液中的氫氧化鈉濃度直接影響顯色液的酸堿度及檢測的準(zhǔn)確性，適宜的氫氧化鈉濃度是流動分析儀準(zhǔn)確測定樣品全氮含量的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，3.0、4.0和5.0 mL硫酸消煮液與對應(yīng)使用緩沖液中的氫氧化鈉量比值在0.158～0.164，趨于一致，且測定的全氮含量精密度及準(zhǔn)確性良好，全氮含量無顯著差異，說明硫酸量與氫氧化鈉濃度比值在0.158～0.164可保證顯色液符合Bertfelot反應(yīng)的顯色條件，該比值可作為完善流動分析儀同時測定土壤和植物樣品全氮含量方法的重要參考依據(jù)。張英利等[11]、中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所[20]、農(nóng)業(yè)部[21]研究表明，以5.0 mL硫酸消煮測定全氮含量所用緩沖液的氫氧化鈉濃度有25.1、29.3和33.0 g/L等，硫酸量與氫氧化鈉濃度比值分別為0.199、0.170和0.156，本研究提出的硫酸量與氫氧化鈉濃度比值均低于0.199，但與0.170和0.156趨近。以上硫酸量與氫氧化鈉濃度比值的差異是否與研究所用儀器及其檢測條件不同有關(guān)，有待于進一步探討。

擴散法通過蒸餾、擴散、吸收及滴定等幾個步驟實現(xiàn)全氮含量測定，與流動分析儀法的檢測原理完全不同[7，22]。目前已有關(guān)于流動分析儀與凱式定氮儀測定氮含量比較的報道，但針對流動分析儀與擴散法測定氮含量的研究甚少[12]。本研究選擇擴散法與流動分析儀法對土壤和植物樣品全氮含量測定結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)二者無顯著差異，但存在顯著線性相關(guān)，說明兩種方法均能準(zhǔn)確測定土壤和植物樣品的氮含量。擴散法測定土壤和植物樣品全氮含量所用的氫氧化鈉濃度達(dá)10.0和5.0 mol/L，檢測100個樣需耗費高濃度氫氧化鈉1.0 L，硼酸指示劑250.0 mL，試劑耗用量和人員工作量大，檢測周期長達(dá)24 h，對批量樣品的檢測存在缺陷[19-21]。而使用流動分析儀檢測100個樣需耗用的緩沖液量小于250.0 mL，耗用水楊酸鈉溶液和次氯酸溶液小于150.0 mL，檢測成本和人員工作強度低，僅用4 h即可完成檢測?？梢?，流動分析儀法檢測準(zhǔn)確高效、經(jīng)濟快速、省工省時，具有較大的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

以凱式消煮法優(yōu)選硫酸量3.0 mL進行土壤和植物樣品消煮，建立以其消煮液測定全氮含量的檢測方法，可確保流動分析儀準(zhǔn)確地同時測定土壤和植物樣品全氮含量。