克雷伯氏菌果膠酸裂解酶基因K-PGL的獲取與序列分析

孔衛(wèi)青，楊金宏

(安康學(xué)院 陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 安康 725000)

【研究意義】果膠是廣泛存在于植物細(xì)胞間隙和初生壁中的一組多糖，是植物細(xì)胞組織間的粘合劑。構(gòu)成果膠的基本單元是不同酯化度的D-半乳糖醛酸，以(α-1,4糖苷鍵相連接作為主鏈，以木糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖等連接在其主鏈上作為支鏈[1]。果膠與病源微生物對(duì)植物的侵染[2]，花粉管萌發(fā)、花粉胞壁擴(kuò)張和果實(shí)的成熟[3]，植物枝葉飼用價(jià)值的提高等方面關(guān)系密切[4]。果膠酶是一類分解果膠物質(zhì)的酶的總稱，廣泛應(yīng)用于紡織、食品、飼料、造紙、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)，是研究的熱點(diǎn)[5]。果膠酸裂解酶(Pectate Lyase，PL)又稱多聚半乳糖醛酸酶，是果膠酶的一種，通過裂解低甲酯或脫甲基的同型聚半乳糖醛羧之間的(α-1,4糖苷鍵，降解細(xì)胞壁中果膠物質(zhì)[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】果膠酸裂解酶可由植物、真菌、細(xì)菌和部分昆蟲產(chǎn)生[7]，在洗衣和紡織品處理等需要中性或堿性條件下的工藝中有良好效果[8]?？死撞暇鷮偈莵碜阅c桿菌科的一種革蘭氏陰性桿菌，該菌廣泛分布于自然界，不同的克雷伯氏菌能夠分泌不同的胞外酶，如纖維素酶、蛋白酶、卵磷脂酶、果膠酸裂解酶等[9-12]，其中部分具有重要的利用價(jià)值，如KlebsiellaplanticaL03[13]、KlebsiellaoxytocaYN201309[14]、Klebsiellavariicla[15]，分布于植株根部，是一種根系聯(lián)合固氮微生物資源；Klebsiellasp. Y1果膠酸裂解酶的低溫活性在紡織工業(yè)具有重要應(yīng)用[16]。【本研究切入點(diǎn)】根據(jù)NCBI登錄的克雷伯氏菌屬基因組分析，僅部分菌株具有果膠酸裂解酶基因，其獲得和缺失的原因尚不明確，而且未見對(duì)克雷伯氏菌屬果膠酸裂解酶基因的生物信息學(xué)研究的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克雷伯氏菌AKB01具有胞外果膠酸裂解酶活性，本研究獲得了其果膠酸裂解酶基因，并分析其結(jié)構(gòu)特征、氨基酸組成，菌屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為進(jìn)一步果膠酸裂解酶的生物學(xué)功能及其利用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種的培養(yǎng)

克雷伯氏菌AKB01從新鮮蠶沙中分離，保存于安康學(xué)院陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分室。挑取單菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖1.0 %，酵母膏0.5 %，pH 8.6)，30 ℃，160 r/min，培養(yǎng)過夜，備用。

1.2 菌株基因組的提取與果膠酸裂解酶基因的擴(kuò)增

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，DP302)提取培養(yǎng)的克雷伯氏菌的基因組DNA，根據(jù)NCBI已登錄的克雷伯氏菌屬基因組注釋的果膠酸裂解酶基因的序列，設(shè)計(jì)2條兼并引物PLF和PLR(表1)，擴(kuò)增果膠酸裂解酶基因的核心保守序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：變性95 ℃ 5 min；30 個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min；終延伸72 ℃ 10 min。

1.3 果膠酸裂解酶基因全長(zhǎng)序列的獲取

根據(jù)果膠酸裂解酶基因已知序列設(shè)計(jì)1對(duì)N端擴(kuò)增引物5BF和5BR(表1)，對(duì)N端序列進(jìn)行擴(kuò)增；設(shè)計(jì)2條C端擴(kuò)增引物3BSP1和3BSP2(表1)，與TaKaRa染色體步移試劑盒中的AP1引物進(jìn)行巢式PCR，擴(kuò)增基因的C端序列。

表1 文中使用引物序列

1.4 序列結(jié)構(gòu)與特征分析

Bioedit v7.2.5對(duì)序列進(jìn)行拼接[17]，SignalP 5.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽及切割位點(diǎn) (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。在線Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)，NCBI在線CDD預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)，SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr)。

1.5 進(jìn)化分析

NCBI下載腸桿菌科不同克雷伯氏菌屬的果膠酸裂解酶序列，Clustal X 1.83軟件對(duì)下載序列進(jìn)行多序列比對(duì)[18]，MEGA X軟件的極大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展法(boot-strap)重復(fù)檢驗(yàn)1000次，分析系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酸裂解酶基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定

以提取的克雷伯氏菌的總DNA為模板，PLF 和PLR 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)約800 bp 的條帶(圖1A)，進(jìn)一步測(cè)序得到果膠酸裂解酶基因783 bp的核心序列。利用N端序列擴(kuò)增引物5BF和5BR進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1B)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序獲得果膠酸裂解酶基因N端590 bp的序列。利用設(shè)計(jì)的2條C端擴(kuò)增引物和染色體步移試劑盒的AP1引物進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增(圖1C)，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序得到C端序列1315 bp。

2.2 果膠酸裂解酶基因全長(zhǎng)序列拼接與序列分析

拼接所得3條序列，得到克雷伯氏菌的序列2395 bp(GenBank登錄號(hào)：MH939201)，其中果膠酸裂解酶基因開放閱讀框1710 bp，編碼569個(gè)氨基酸(圖2)。SignalP 5.0預(yù)測(cè)編碼蛋白含I型信號(hào)肽，切割位點(diǎn)位于第22和23位氨基酸殘基之間，為典型的A-X-A結(jié)構(gòu)(AGA-QE)，切割效率0.864，是分泌蛋白，命名為K-PGL。NCBI在線CDD分析K-PGL基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)自16～569位氨基酸為PGL家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，屬于內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶家族基因[20]。

圖1 果膠酸裂解酶基因核心(A)、N端(B)和C端(C)序列的PCR擴(kuò)增

箭頭處為信號(hào)肽切割位點(diǎn)The black arrow showed the signal cleavage site

2.3 K-PGL蛋白的氨基酸組成與疏水性分析

Protparam預(yù)測(cè)K-PGL編碼蛋白的分子質(zhì)量為63.37 KDa，理論等電點(diǎn)7.17，分子式C2853H4385N773O844S11。氨基酸組成分析結(jié)果顯示，K-PGL蛋白由19種氨基酸組成，以Leu所占比例最高，為11.6 %；含153個(gè)極性不帶電氨基酸(N25，Q27，D28，T32，Y30，M11)，142個(gè)帶電荷氨基酸(酸性氨基酸D40，E26，堿性氨基酸K38，R28，H10)。序列中不含半胱氨酸Cys，預(yù)測(cè)不穩(wěn)定系數(shù)21.39，推測(cè)該蛋白是穩(wěn)定存在蛋白(穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)穩(wěn)定)[21]。

氨基酸疏水性分析(圖3)顯示，K-PGL含有274個(gè)疏水氨基酸(A62，L66，F(xiàn)25，I16，W10，V21，G51，P23，預(yù)測(cè)該蛋白脂肪系數(shù)為77.80 %，總平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity gravy)為-0.449，是親水性蛋白。

2.4 K-PGL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SOPMA軟件分析K-PGL編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示其中含有38.49 %的α螺旋(α-helix)，11.78 %的β折疊(extended strand)，5.98 %的β-轉(zhuǎn)角(beta turn)和43.76 %的無規(guī)則卷曲(random coil)(圖4)，比例與其他果膠酸裂解酶基因基本一致[22]。

圖3 K-PGL蛋白的疏水性預(yù)測(cè)

α螺旋，β折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別由線段長(zhǎng)度由長(zhǎng)到短(上)和線段灰度由灰到黑(下)表示The α-helix, extended strand, β-turn and random coil are indicated by the length of line segment from long to short (up), and the line grayscale from gray to black (down), respectively

2.5 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

從 NCBI網(wǎng)站下載腸桿菌科耶爾森氏菌屬(Yersinia)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、Kosakonia屬、拉烏爾菌屬(Raoultella)等的K-PGL基因序列，利用MEGA X軟件的極大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果運(yùn)行的logL=-5441.26，除了克雷伯氏菌屬內(nèi)的兩個(gè)菌種的支持率為65，其它分支都大于70，結(jié)果較為可靠，能夠反映腸桿菌科內(nèi)不同菌屬的發(fā)育關(guān)系。本研究獲得的K-PGL基因與產(chǎn)酸克雷伯氏菌的同源基因的親緣關(guān)系最近，所有來源于同一個(gè)菌屬的K-PGL基因大都聚在一起，7個(gè)屬的K-PGL基因聚合為3個(gè)獨(dú)立的分支。其中克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、Kosakonia屬聚為一大支，耶爾森氏菌屬和果膠桿菌屬聚為一支，鹽單胞菌屬和拉烏爾菌屬單獨(dú)聚為一支位于基。

3 討 論

果膠酸裂解酶來源廣泛，根據(jù)底物和作用方式不同分為內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶、外切聚半乳糖醛酸裂解酶、內(nèi)切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶、外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶4種[20]。本研究克隆了克雷伯氏菌的果膠酸裂解酶基因K-PGL，編碼蛋白的N 端含有信號(hào)肽序列，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，同時(shí)內(nèi)部有PGL家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，符合內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶家族特征。該基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，克雷伯氏菌與腸桿菌屬最為接近，Kosakonia屬是從腸桿菌屬劃分出來的新屬[23]，它們共同處在一個(gè)分枝，進(jìn)化關(guān)系最近。這與基于16SrDNA和rpoB基因[24]或全基因組序列[25]的研究結(jié)果一致，但本研究自展支持值更高，確定K-PGL為內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶家族新成員，該基因較為保守，可以用與種屬進(jìn)化分析。

圖5 K-PGL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

不同來源的果膠酶生化性質(zhì)差異較為明顯，按活性最適pH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。酸性果膠酶多由真菌產(chǎn)生[26]，黑曲霉、煙曲霉和瑞氏木霉等酸性氨基酸的比例均高于其堿性氨基酸含量，可能與其耐酸性質(zhì)有一定關(guān)系，而且耐酸的程度與其酸性氨基酸的比例有關(guān)[27]。堿性果膠酶多由細(xì)菌中的桿菌屬和假單胞菌屬產(chǎn)生，放線菌和真菌產(chǎn)堿性果膠酶也有報(bào)道。本研究果膠酸裂解酶基因K-PGL具有142個(gè)帶電荷的氨基酸，堿性氨基酸76個(gè)，多于酸性氨基酸66個(gè)，堿性氨基酸的含量高可能是其耐堿性的原因。

K-PGL預(yù)測(cè)不穩(wěn)定系數(shù)21.39，遠(yuǎn)小于40，推測(cè)該蛋白是穩(wěn)定存在的蛋白[21]。半胱氨酸Cys能夠改變蛋白質(zhì)分子之間和蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的二硫鍵，與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和正確折疊具有重要關(guān)系[28]。本研究發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌屬果膠酸裂解酶基因序列中不含有Cys是一個(gè)保守存在的現(xiàn)象(目前NCBI公布的100余條序列中，僅僅發(fā)現(xiàn)有1條序列含有1個(gè)Cys)，對(duì)于其Cys缺失的進(jìn)化機(jī)制及其穩(wěn)定性的生物學(xué)意義，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究獲得了克雷伯氏菌AKB01的果膠酸裂解酶基因全長(zhǎng)序列，基因編碼569個(gè)氨基酸，編碼蛋白具有信號(hào)肽。與部分克雷伯氏菌屬序列一樣，不含有Cys，為進(jìn)一步果膠酸裂解酶的生物學(xué)功能及其利用研究提供參考。