HBx基因?qū)epG2.2.15細(xì)胞MICA-A5.1表達(dá)及侵襲、遷移的影響

李 沛， 劉 宇

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科； b.急診科， 湖南 衡陽(yáng) 421001

肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第三位的惡性腫瘤疾病[1]，發(fā)病率髙，預(yù)后差，病情進(jìn)展快，易侵襲轉(zhuǎn)移，生存期短。據(jù)報(bào)道[2-3]，在全球每年新增肝癌病例中，約一半發(fā)生在我國(guó)，已成為威脅我國(guó)人群健康安全的主要原因。研究[4]表明，HBV感染是引發(fā)肝癌的重要因素，HBV攜帶者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)極大提高，HBx蛋白作為HBV基因編碼的7個(gè)蛋白之一，可調(diào)節(jié)相關(guān)癌基因、抑癌基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌發(fā)生[5]，HBx蛋白可通過(guò)下調(diào)miR-200a-3p表達(dá)而調(diào)控HBV感染患者肝癌細(xì)胞活力和細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn)其增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[6]。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類鏈相關(guān)基因A(MHC classⅠ chain-related gene A，MICA)是人類MHC基因Ⅰ類亞區(qū)的一種基因亞型[7]，MICA-A5.1是其第5外顯子的等位基因，可轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生可溶性MICA(soluble MICA，sMICA)分子，其與肝癌發(fā)生相關(guān)，sMICA水平高的肝硬化患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)最高[8]，有研究[9]表明，sMICA可促使人骨肉瘤的侵襲及免疫逃逸，抑制其表達(dá)，可恢復(fù)抗腫瘤免疫，并抑制腫瘤進(jìn)展，但HBx基因?qū)epG2.2.15細(xì)胞MICA-A5.1表達(dá)及侵襲、遷移的影響目前尚不清楚，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15(寧波明舟生物科技有限公司，貨號(hào)：MZ-1350)；HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、HBx空載質(zhì)粒、HBx siRNA、HBx siRNA陰性對(duì)照由上海吉瑪基因有限公司構(gòu)建合成；MEM培養(yǎng)基(武漢純度生物科技有限公司，貨號(hào)：CD-100044GM)；胎牛血清FBS、胰蛋白酶、青鏈霉素(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)分別為：10099-141、15050057、10378016)；sMICA 酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司，貨號(hào)：AE90082Hu)；兔源GAPDH、HBx、E-cadherin、MICA及Vimentin一抗、羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab181602、ab39716、ab76319、ab62540、ab193555、ab150077)；伊紅染色液、蛋白裂解液、CKK-8試劑盒、BCA試劑盒(上海碧云天公司，貨號(hào)分別為：C0109、P0013K、C0037、P0011)。

1.2 主要儀器 Olympus CKX41顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 股份公司)；Model 680酶標(biāo)儀、1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜儀、CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(日本尼康公司)。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(批號(hào)：LL201700008)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將購(gòu)買的人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15快速解凍復(fù)蘇，以完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基)重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至85%左右時(shí)，以胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組、HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組、HBx空載質(zhì)粒組、HBx siRNA組、HBx siRNA陰性對(duì)照組，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，參照LipofectamineTM2000的說(shuō)明書步驟，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及siRNA(質(zhì)粒及siRNA濃度參照各自說(shuō)明書)分別以50 μl Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基溶解混勻，同時(shí)以50 μl Opti-MEM減血清培養(yǎng)基溶解混勻1 μl LipofectamineTM2000，均靜置20 min，將 LipofectamineTM2000溶液分別與質(zhì)粒及siRNA溶液合并后輕輕混勻，然后按組別分別處理細(xì)胞，以O(shè)pti-MEM減血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞6 h后，將其更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 CKK-8實(shí)驗(yàn) 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞以0.6×105個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，分別在12 h、24 h、48 h后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀中振蕩混勻后檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下各孔吸光度(optical density，OD)，計(jì)算各組細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。公式為：細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組 OD 值/對(duì)照組 OD 值 ×100%。

1.4.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞接種于24孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，于12 h后收集各組細(xì)胞，加入無(wú)血清的MEM培養(yǎng)基分別重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞液濃度調(diào)整為5×105個(gè)/ml，取200 μl加入基質(zhì)膠包被過(guò)的Transwell上室，在其下室加入含有10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室，以PBS漂洗細(xì)胞后，加入4%多聚甲醛于室溫下固定，然后以棉簽輕輕擦除基質(zhì)膠及上室內(nèi)細(xì)胞，加入500 μl 0.5%伊紅染液，于室溫下染色，最后用Olympus CKX41顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞，并任選5個(gè)視野拍照，對(duì)其計(jì)數(shù)并記錄，以此作為評(píng)判細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。

1.4.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，于12 h后以200 μl槍頭在六孔板中心劃一條直線(以無(wú)菌直尺作為標(biāo)尺)，使用PBS將劃痕中的細(xì)胞漂洗干凈，然后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在Olympus CKX41顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)目，任選5個(gè)視野拍照，對(duì)其計(jì)數(shù)并記錄，以此作為評(píng)判細(xì)胞遷移能力的指標(biāo)。

1.4.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞接種于24孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，于12 h后收集各組細(xì)胞，以蛋白裂解液及BCA試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白并測(cè)定其濃度，具體操作步驟參照說(shuō)明書，制備SDS凝膠，各組取含相同質(zhì)量蛋白的樣品液進(jìn)行電泳，然后濕轉(zhuǎn)將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別經(jīng)兔源HBx、E-cadherin、Vimentin、MICA、GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，羊抗兔二抗室溫孵育2 h后，最后以增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，以Image Lab軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 HBx基因?qū)?xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞活力在24 h、48 h均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為8.268、12.680，P值均<0.001)；HBx siRNA組細(xì)胞活力在24 h、48 h均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為4.365、7.523，P值分別為0.036、<0.001)；為保證侵襲遷移實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，避免HBx基因?qū)?xì)胞活力的影響，故選擇藥物作用時(shí)間為12 h(表1)。

表1 HBx基因?qū)?xì)胞活力的影響(%)

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞HBx、MICA-A5.1蛋白表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)基中sMICA水平的檢測(cè) 與對(duì)照組比較，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞HBx及MICA蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞培養(yǎng)基中sMICA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為9.427、6.697、5.042，P值分別為<0.001、0.001、0.006)；HBx siRNA組細(xì)胞HBx及MICA蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞培養(yǎng)基中sMICA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為8.133、8.828、7.673，P值均<0.001)(圖1，表2)。

注：A，對(duì)照組；B，HBx空載質(zhì)粒組；C，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組；D，HBx siRNA陰性對(duì)照組；E，HBx siRNA組。

表2 各組細(xì)胞HBx、MICA-A5.1蛋白相對(duì)表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)基中sMICA水平

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.3 HBx基因?qū)?xì)胞遷移的影響 與對(duì)照組比較，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組遷移的細(xì)胞數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=22.740，P<0.001)；HBx siRNA組遷移的細(xì)胞數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.391，P=0.007)(圖2，表3)。

注：a，對(duì)照組；b，HBx空載質(zhì)粒組；c，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組；d，HBx siRNA陰性對(duì)照組；e，HBxsiRNA組。

圖2HBx基因?qū)?xì)胞遷移的影響

表3 HBx基因?qū)?xì)胞遷移的影響

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.4 HBx基因?qū)?xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組比較，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組侵出Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=15.720，P<0.001)；HBx siRNA組侵出Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=7.694，P<0.001)(圖3，表4)。

2.5 HBx基因?qū)?xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志蛋白E-cadherin、Vimentin的影響 與對(duì)照組比較，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)降低，Vimentin表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為5.258、10.500，P值分別為0.008、<0.001)；HBx siRNA組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)升高，Vimentin表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為6.226、7.616，P值分別為0.002、<0.001)(圖4，表5)。

注：a，對(duì)照組；b，HBx空載質(zhì)粒組；c，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組；d，HBx siRNA陰性對(duì)照組；e，HBxsiRNA組。

圖3HBx基因?qū)?xì)胞侵襲的影響

表4 各組侵出Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目比較

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

注：A，對(duì)照組；B，HBx空載質(zhì)粒組；C，HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組；D，HBx siRNA陰性對(duì)照組；E，HBx siRNA組。

圖4EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、Vimentin的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

表5 各組細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、Vimentin的相對(duì)表達(dá)水平

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

肝癌的治療以手術(shù)后放化療為主，但因早期腫瘤的轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)，其治療效果不能令人滿意，提高對(duì)肝癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的理解對(duì)于肝癌的臨床治療具有重要意義。肝癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，是病毒感染、飲食習(xí)慣、遺傳等多因素長(zhǎng)期相互作用的綜合結(jié)果[10-12]，其中，HBV感染是肝癌的主要致病因素[13]，合并HBV感染的肝癌患者病情進(jìn)展快、生存期極短[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞Huh-7感染HBV后，HBV基因編碼的HBx蛋白在Huh-7細(xì)胞中表達(dá)，且其遷移侵襲能力增強(qiáng)，IFNα可通過(guò)促進(jìn)其表達(dá)抗病毒蛋白而減少細(xì)胞遷移及侵襲，進(jìn)而減輕HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展。因而，HBx基因可能調(diào)控HBV感染的HepG2細(xì)胞HepG2.2.15的侵襲、遷移。本研究以插入HBV全基因組并持續(xù)表達(dá)的HepG2細(xì)胞系HepG2.2.15作為研究對(duì)象，探討HBx基因?qū)epG2.2.15細(xì)胞侵襲、遷移的影響，以CKK-8檢測(cè)HBx基因?qū)epG2.2.15細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HBx基因可提升細(xì)胞活力，下調(diào)HBx基因可降低細(xì)胞活力，在HBx siRNA處理HepG2.2.15細(xì)胞24 h后其細(xì)胞活力約為59.36%，為保證侵襲遷移實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，避免HBx siRNA對(duì)細(xì)胞活力的影響，故本研究選擇藥物作用時(shí)間為12 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，EMT是癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，向機(jī)體別處侵襲的關(guān)鍵病理過(guò)程[16]，期間細(xì)胞極性逐漸消失，上皮細(xì)胞表型逐漸轉(zhuǎn)化為具有較高遷移與侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞表型，同時(shí)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)升高[17]。本研究以HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)HBx基因可使細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)、遷移細(xì)胞數(shù)目、侵出Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目升高，E-cadherin表達(dá)降低；以HBx siRNA下調(diào)HBx基因可使細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)、遷移細(xì)胞數(shù)目、侵出Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目降低，E-cadherin表達(dá)升高，表明HBx基因可介導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，抑制其表達(dá)，能夠降低HBV感染的HepG2.2.15細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步證實(shí)了HBV基因能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移侵襲及癌癥進(jìn)展。

MICA基因含有6個(gè)外顯子，MICA-A5.1作為其第5外顯子等位基因，可使蛋白質(zhì)翻譯提前結(jié)束，從而相比其他外顯子更易形成sMICA分子，當(dāng)其被腫瘤、病毒或細(xì)菌等刺激時(shí)，可表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生更多的sMICA分子。研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，MICA基因型及sMICA水平與慢性丙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)生顯著相關(guān)，降低sMICA水平對(duì)治療索拉非尼耐藥的肝細(xì)胞癌有效。此外，sMICA水平在胰腺癌組織中的表達(dá)水平異常且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷胰腺癌預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[20]，因此，MICA-A5.1基因是調(diào)控HepG2.2.15細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛在作用靶點(diǎn)，但HBV基因是否可調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而影響HepG2.2.15細(xì)胞侵襲的轉(zhuǎn)移，目前還未見(jiàn)研究。本研究對(duì)此進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，上調(diào)HBx基因可升高HepG2.2.15細(xì)胞HBx、MICA蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)基中sMICA水平，促使HBV感染的HepG2.2.15細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移；下調(diào)HBx基因可降低細(xì)胞HBx、MICA蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)基中sMICA水平，抑制HepG2.2.15細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，表明HBx基因可上調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中MICA-A5.1基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移，揭示了HBx基因促進(jìn)HBV感染的HepG2.2.15細(xì)胞的侵襲遷移的作用機(jī)制可能是下調(diào)MICA-A5.1基因。

總之，HBx基因可調(diào)控HBV感染的HepG2.2.15細(xì)胞中MICA-A5.1基因表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，上調(diào)該基因可促進(jìn)HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)MICA-A5.1基因，進(jìn)而增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移能力，表明調(diào)控MICA-A5.1基因表達(dá)可能是HBx基因介導(dǎo)HBV感染的HepG2.2.15細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制之一。但本研究只是進(jìn)行了初步研究，未通過(guò)上調(diào)及下調(diào)MICA-A5.1基因進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，也未涉及HBx調(diào)控MICA基因的具體分子機(jī)制，需要后續(xù)進(jìn)一步深入研究。