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    主養(yǎng)草魚(yú)池塘中氨氧化古菌的多樣性和種群分布

    2020-04-23 06:16:20劉承情代梨梨宋超峰李曉莉
    淡水漁業(yè) 2020年2期
    關(guān)鍵詞:文庫(kù)類(lèi)群沉積物

    劉承情,代梨梨,宋超峰,彭 亮,李曉莉,陶 玲,李 谷

    (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,武漢430223;2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院,上海201306)

    微生物驅(qū)動(dòng)的氮循環(huán)在氮的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用,其中主要由氨氧化微生物參與的氨氧化過(guò)程是硝化作用過(guò)程中的第一步,也是限速步驟[1],受到各界學(xué)者的廣泛關(guān)注。而21世紀(jì)以來(lái),古菌氨單加氧酶α亞基(Ammonia monooxygenase α-subunit,amoA)基因的發(fā)現(xiàn)[2]和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)NitrosopumilusmaritimusSCM1的分離培養(yǎng)[3],使得對(duì)氨氧化微生物的研究從細(xì)菌域擴(kuò)展到古菌域。Pester等[4]把AOA分為五類(lèi),分別是Nitrosopumiluscluster(group I.1a),Nitrosotaleacluster(group I.1a-associated),Nitrososphaeracluster(group I.1b),Nitrososphaerasister cluster,和Nitrosocalduscluster(ThAOA),其中Nitrososphaerasister cluster類(lèi)群中還未有AOA被分離。

    目前AOA在養(yǎng)殖環(huán)境中的研究還非常有限,且多集中于海水和循環(huán)水養(yǎng)殖。例如三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘中的研究表明水體中的AOA多屬于Nitrosopumiluscluster[5];南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘沉積物中的研究則表明AOA群落結(jié)構(gòu)比較單一,且大多屬于泉古菌門(mén)(Crenarchaeote)[6];在淡水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行的研究表明AOA的多樣性和豐度都高于氨氧化細(xì)菌(AOB),且認(rèn)為AOA在其中起著主要作用[7]。池塘養(yǎng)殖作為我國(guó)最主要的淡水養(yǎng)殖方式,通過(guò)研究養(yǎng)殖池塘環(huán)境中的氨氧化微生物,特別是氨氧化古菌,對(duì)于養(yǎng)殖過(guò)程中因配合飼料的大量使用而導(dǎo)致的有害氮素的去除具有重要意義,且能夠豐富當(dāng)前氨氧化微生物的研究?jī)?nèi)容。因此在本研究中,我們以我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖區(qū)-湖北荊州地區(qū)的風(fēng)生水起生態(tài)農(nóng)場(chǎng)的主養(yǎng)草魚(yú)池塘為研究對(duì)象,通過(guò)amoA基因研究了淡水養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中氨氧化古菌的多樣性和種群分布,以期為淡水養(yǎng)殖池塘的氮素調(diào)控提供一定的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品采集

    風(fēng)生水起生態(tài)農(nóng)場(chǎng)位于湖北省荊州市荊州區(qū),養(yǎng)殖水域由長(zhǎng)江故道改造而來(lái),長(zhǎng)1 200 m,寬90 m,總面積為108 000 m2,平均水深為4~5 m,底泥深度約為1 m,故道的兩端已通過(guò)筑壩與外界水體隔離開(kāi)來(lái)。池塘中主養(yǎng)草魚(yú),套養(yǎng)花白鰱和團(tuán)頭魴。在該養(yǎng)殖池塘中通過(guò)圍隔分為3個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域(分別標(biāo)記為F1、F2、F3)。養(yǎng)殖早期(2017年5月25日)在每個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)(呈等邊三角),使用彼得遜采泥器采集沉積物,均勻混合后裝入滅菌的封口聚乙烯袋,使用有機(jī)玻璃采水器采集水樣,混勻后裝入500 mL聚乙烯瓶中。樣品采集完成后立即低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,水樣用濾膜過(guò)濾儲(chǔ)存于-20 ℃,沉積物樣品分裝后部分風(fēng)干并過(guò)篩,儲(chǔ)存于4 ℃或-20 ℃以用于后續(xù)分析。采樣區(qū)域沉積物和水體理化指標(biāo)見(jiàn)表1。

    表1 沉積物和水體的理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of sediment and water

    1.1.2 主要試劑和儀器

    E.Z.N.A.TMWater DNA Kit試劑盒(Omega),DNeasy?PowerSoil?Kit試劑盒(QIAGEN)、2×Utaq MasterMix(莊盟生物)、10×DreamTaq buffer、DreamTaq DNA Polymerase、2mM dNTP Mix(均購(gòu)自Thermo)、PCR儀(LifeECO)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、電泳儀(DYY-6C型)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 DNA提取

    采用E.Z.N.A.TMWater DNA Kit試劑盒提取養(yǎng)殖水體中的DNA,采用DNeasy?PowerSoil?Kit試劑盒提取養(yǎng)殖池塘沉積物中DNA,提取方法基于試劑盒說(shuō)明方法,考慮到沉積物沉積物的含水率以及所提DNA的濃度,實(shí)際操作是加入0.6~1.1 g新鮮土壤,其余按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取。

    1.2.2amoA基因擴(kuò)增

    通過(guò)PCR擴(kuò)增AOAamoA基因,所用的引物為Arch-amoAF/Arch-amoAR,其序列分別是5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′、5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′,沉積物擴(kuò)增的體系為25 μL(2.5 μL 10×DreamTaq buffer、10 μmol/L引物各1.5 μL、2 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL和樣品DNA 1 μL,補(bǔ)ddH2O至25 μL),擴(kuò)增的條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。水體擴(kuò)增的體系25 μL(包括2×Utaq MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L引物各1.5 μL和樣品DNA 1 μL,補(bǔ)ddH2O至25 μL),擴(kuò)增的條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 70 s,32個(gè)循環(huán);80 ℃ 20 s。

    1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化和克隆測(cè)序

    使用SK8131膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物,純化后PCR產(chǎn)物通過(guò)連接試劑盒連接到pUCm-T Vector,將連接好的載體轉(zhuǎn)化入高效大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在涂有X-gal和IPTG的氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,隨機(jī)挑取克隆子至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。使用SK8191 UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒,并測(cè)序(交由上海生工生物工程股份有限公司完成)。

    1.2.4 克隆測(cè)序數(shù)據(jù)分析

    用公式C=1-n/N

    其中C為覆蓋率,即coverage,n為文庫(kù)中只出現(xiàn)1次的克隆數(shù)量,N為該文庫(kù)克隆總數(shù)用于計(jì)算文庫(kù)的覆蓋率。用Mothur 軟件分析克隆文庫(kù)的稀釋性曲線;并分析計(jì)算各文庫(kù)AOAamoA基因多樣性參數(shù)和Shannon指數(shù)。

    1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

    利用Mothur軟件分析克隆序列,并在3%差異度水平上定義為分類(lèi)操作單元(即Operational taxonomic unit,簡(jiǎn)稱(chēng)為OTU)。并結(jié)合NCBI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST分析找到相似度最高的同源序列作為參照序列。將代表性O(shè)TU序列與相似序列一起用于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。使用MEGA 7.0.26,以鄰接法(Neighbor-Joining)迭代運(yùn)算1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 AOA amoA基因的稀釋性曲線和物種多樣性

    各采樣點(diǎn)AOAamoA基因克隆文庫(kù)的稀釋性曲線如圖1所示。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)各點(diǎn)的amoA基因在克隆文庫(kù)中相對(duì)應(yīng)的覆蓋率均在88%以上(表2),并且可以看出各點(diǎn)的曲線在后期均趨向平坦,說(shuō)明本研究中克隆取樣的數(shù)量合理,能夠比較好的反映環(huán)境中的多樣性。

    圖1 AOA amoA基因克隆文庫(kù)稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for AOA amoA gene clonesS-表示沉積物樣品,W-表示水體樣品,F(xiàn)1、F2、F3為3個(gè)采樣點(diǎn)

    基于序列相似性大于97%計(jì)算的AOA OTU數(shù)目和多樣性指數(shù)見(jiàn)表2。可以看出,F(xiàn)1沉積物中AOA OTU的數(shù)目要少于F2和F3,但其水體中的OTU數(shù)目卻要高于后兩者。F1沉積物中的AOA多樣性指數(shù)也要低于F2和F3,但其水體中的多樣性指數(shù)要高于后兩者。說(shuō)明沉積物和水體中AOA的分布存在差異,并非表現(xiàn)出均一性,即并非沉積物中AOA OTU數(shù)目多,其對(duì)應(yīng)水體中OTU數(shù)目就多。通過(guò)對(duì)三個(gè)樣點(diǎn)總體的比較則發(fā)現(xiàn),沉積物AOA的多樣性要高于水體中(OTU數(shù)目均值分別為10.33和7.33),并且沉積物中AOA的多樣性也要高于水體中(Shannon指數(shù)均值分別為1.57和1.38,Simpson指數(shù)均值分別為0.28和0.33)。

    2.2 AOA amoA基因的分布

    基于Mothur對(duì)沉積物和水體中各點(diǎn)的AOAamoA基因文庫(kù)進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2,從圖中可以看出,沉積物和水體樣品分別聚為兩支,且不論是在沉積物還是在水體中,F(xiàn)2和F3中的AOA都更為相似,這也與OTU數(shù)目和多樣性的結(jié)果一致。

    表2 AOA amoA基因克隆文庫(kù)多樣性Tab.2 AOA diversity index in amoA gene clone library

    基于3%的序列差異度分析發(fā)現(xiàn),沉積物和水體中共檢測(cè)到24個(gè)OTU,其中沉積物中有18個(gè)OTU,水體中有13個(gè)OTU。沉積物和水體中共有的OTU包括OTU01、OTU02、OTU05、OTU07、OTU11、OTU13、OTU16,而OTU03、OTU04、OTU18、OTU19、OTU20、OTU21僅存在于水體中,其他序列OTU06、OTU08、OTU09、OTU10、OTU12、OTU14、OTU15、OTU17、OTU22、OTU23、OTU24僅存在于沉積物中,并且OTU01、OTU02在所有樣點(diǎn)的沉積物和水體中均有檢測(cè)到,這說(shuō)明OTU01、OTU02是養(yǎng)殖池塘中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,分別占克隆子的47.38%和21.84%。

    圖2 沉積物和水體中AOA amoA 基因文庫(kù)聚類(lèi)分析圖Fig.2 Clustering diagram analysis of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water

    進(jìn)一步通過(guò)venn圖分別比較了各樣點(diǎn)沉積物和水體中AOAamoA基因文庫(kù)中OTU的分布情況,見(jiàn)圖3。在沉積物中(圖3左),F(xiàn)1獨(dú)有的OTU是OTU13、OTU14、OTU16,F(xiàn)2獨(dú)有的OTU是OTU17、OTU22,F(xiàn)3獨(dú)有的OTU是OTU11、OTU15、OTU23、OTU24;而F1和F2所共有的OTU有6個(gè),分布是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08,OTU10和OTU12,F(xiàn)1和F3所共有的OTU僅有4個(gè),分別是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08;F2和F3所共有的7個(gè)OTU分別是OTU01、OTU02、OTU05、OTU06、OTU7、OTU08、OTU09。在水體中(圖3右),三個(gè)樣點(diǎn)中F1所獨(dú)有的5個(gè)OTU是:OTU05、OTU07、OTU13、OTU18、OTU20;OTU16是F2所獨(dú)有的OTU;OTU19、OTU21是F3所獨(dú)有的OTU。而F1和F2、F2和F3共有的OTU都有4個(gè),F(xiàn)1、F2、F3共有的OTU也是4個(gè),分別是OTU01、OTU02、OTU03和OTU04,此外F1和F3還共有一個(gè)OTU是OTU11。

    圖3 沉積物和水體中AOA amoA 基因文庫(kù)OTU分布韋恩圖Fig.3 Venn diagram of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water左:沉積物;右:水體。圖中數(shù)字表示OTU數(shù)目。

    2.3 AOA amoA 基因系統(tǒng)發(fā)育分布

    以鄰接法(Neighbor-Joining)對(duì)沉積物和水體中的AOAamoA基因的OTU序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),見(jiàn)圖4。在圖中可見(jiàn),AOAamoA基因的OTU序列主要屬于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster,而未檢測(cè)到Nitrosocaldus cluster 和Nitrosotalea cluster。其中隸屬Nitrososphaerasister group的OTU有:OTU01、OTU02、OTU03、OTU04、OTU05、OTU08、OTU09、OTU10、OTU11、OTU13、OTU16、OTU17、OTU18、OTU19、OTU21、OTU24;隸屬Nitrososphaeracluster的OTU有:OTU12、OTU14、OTU15、OTU20;隸屬Nitrosopumiluscluster的OTU有:OTU06、OTU07、OTU22、OTU23。

    與沉積物和水體中AOAamoA基因的分布的比較發(fā)現(xiàn),沉積物和水體的共有序列除OTU07外,均屬于Nitrososphaerasister group。水體中除OTU07和OTU20外,均屬于Nitrososphaerasister group。而沉積物中則包含檢測(cè)到的Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster中的大多數(shù)種類(lèi)。各樣點(diǎn)沉積物和水體中AOA系統(tǒng)類(lèi)群的組成情況見(jiàn)圖5,可以發(fā)現(xiàn)各樣點(diǎn)間的AOA組成存在一定差異,但從總體上來(lái)看,水體中的AOA比較單一,幾乎都為Nitrososphaerasister類(lèi)群,而沉積物中Nitrososphaerasister類(lèi)群雖然也占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì),但也包含相對(duì)較多的其他類(lèi)群。

    3 討論

    已有研究表明AOA相比AOB更適合厭氧環(huán)境[8],且在水體[9]和土壤[10]等環(huán)境中AOAamoA基因的豐度和多樣性都更為豐富。近年來(lái)已有相關(guān)研究證實(shí)了在養(yǎng)殖池塘中存在AOA,其中多數(shù)研究都能在沉積物中檢測(cè)到AOAamoA基因,而部分研究則未能在水體中檢測(cè)到AOA,這可能是受到光抑制的影響。在本研究中,我們基于amoA基因的克隆文庫(kù)技術(shù),對(duì)主養(yǎng)草魚(yú)池塘中的AOA進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖池塘的沉積物和水體中均存在AOA,但二者中的分布存在著差異。

    在早期的研究中,已發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖過(guò)程的推進(jìn),池塘水體中的氨氧化微生物數(shù)量會(huì)下降,甚至難以檢測(cè)到氨氧化古菌[11]。在本研究中,通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖前期的分析發(fā)現(xiàn),不同養(yǎng)殖水體中均檢測(cè)到AOA的存在,說(shuō)明養(yǎng)殖過(guò)程可能會(huì)對(duì)池塘水體中的氨氧化古菌造成不利的影響。另外,對(duì)不同養(yǎng)殖區(qū)域沉積物和水體的比較發(fā)現(xiàn),池塘沉積物中的AOA無(wú)論是種類(lèi)數(shù)還是多樣性都要高于水體,而且高于在其他環(huán)境中檢測(cè)到的AOA OTU數(shù)目[12],說(shuō)明養(yǎng)殖池塘沉積物中可能存在更為豐富的AOA種類(lèi)。在養(yǎng)殖池塘的區(qū)域分布上,我們對(duì)不同樣點(diǎn)的比較發(fā)現(xiàn),F(xiàn)1沉積物中的AOA種類(lèi)數(shù)和多樣性都要低于F2和F3,但F1水體中的種類(lèi)數(shù)和多樣性要高于F2和F3,說(shuō)明養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中的AOA存在著差異,AOA在二者中可能分別具有相對(duì)獨(dú)立的生態(tài)位。目前還沒(méi)有比較養(yǎng)殖環(huán)境中AOA在沉積物和水體中的分布規(guī)律,這可能有待進(jìn)一步研究。我們對(duì)沉積物和水體中OTU的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),沉積物和水體中除存在少量的共有OTU外,還分別具有各自獨(dú)立存在的OTU,但檢測(cè)到的OTU共有序列數(shù)量在總體上占據(jù)絕大優(yōu)勢(shì),說(shuō)明養(yǎng)殖環(huán)境中具有廣分布生態(tài)位的種類(lèi)可能更具優(yōu)勢(shì),但這還需要進(jìn)一步的研究。

    圖4 基于amoA基因構(gòu)建的養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中氨氧化古菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis of archaeal amoA gene sequences retrieved from the aquaculture ponds of sediment and water

    圖5 沉積物和水體中AOA系統(tǒng)類(lèi)群的組成圖Fig.5 Composition of AOA species in sediment and water

    從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來(lái)看,養(yǎng)殖池塘系統(tǒng)中的AOAamoA基因序列與來(lái)自土壤、沉積物、水體及部分污水處理系統(tǒng)的基因序列高度相似。本研究測(cè)得的AOA包括Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster類(lèi)群。先前有研究表明在養(yǎng)殖池塘表層沉積物中的AOA主要屬于Nitrososphaera類(lèi)群,而在較深層的沉積物中的AOA主要屬于Nitrosopumilus類(lèi)群[11],另外針對(duì)養(yǎng)殖池塘水體中的研究也證明AOA絕大多數(shù)屬于Nitrosopumilus類(lèi)群[5]。這與本研究中的結(jié)果存在著一定的差異,本研究中測(cè)得的74%的OTU序列都屬于Nitrososphaerasister group,水體和沉積物共有的OTU除OTU07屬于Nitrosopumiluscluster外,其它序列均屬于Nitrososphaerasister類(lèi)群;而沉積物中除包含少量的Nitrososphaera類(lèi)群外,主要的OTU仍然為Nitrososphaerasister類(lèi)群,這說(shuō)明Nitrososphaerasister類(lèi)群可能是該主養(yǎng)草魚(yú)池塘中最重要的氨氧化功能類(lèi)群。Nitrososphaerasister類(lèi)群由Pester等[4]首次提出,與Nitrososphaera類(lèi)群有共同的祖先,但與AOA其他類(lèi)群分離開(kāi)來(lái)。雖然目前已發(fā)現(xiàn)Nitrososphaerasister類(lèi)群在陸地環(huán)境中分布廣泛且數(shù)量豐富[12],但關(guān)于該類(lèi)群的了解還很少,甚至還存在一定的爭(zhēng)議。例如,有證據(jù)表明amoA相關(guān)的Thaumarchaeota為異養(yǎng)型或兼養(yǎng)型,因?yàn)樗鼈冊(cè)诩尤胗袡C(jī)物質(zhì)時(shí)生長(zhǎng)會(huì)加快[13]。而在其他的研究中,卻發(fā)現(xiàn)該類(lèi)群的富集物能夠在自養(yǎng)條件下生長(zhǎng)[14]。另外在湖泊沉積物中也發(fā)現(xiàn)Nitrososphaerasister類(lèi)群Thaumarchaeota能夠固定二氧化碳[15]。雖然在本研究中草魚(yú)池塘沉積物和水體中的高有機(jī)質(zhì)和氨氮水平可能有利于Nitrososphaerasister類(lèi)群的發(fā)展,但其群落動(dòng)態(tài)和影響因素還有待進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    綜上所述,在主養(yǎng)草魚(yú)養(yǎng)殖池塘的水體和沉積物中均存在較為豐富的AOA,且在水體和沉積物中的分布存在差異。AOA在養(yǎng)殖池塘不同區(qū)域中的分布也存在差異。AOA主要屬于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster,但Nitrososphaerasister group是優(yōu)勢(shì)種群,占了AOA種群的絕大部分。

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