延遲首次投喂對烏江中華倒刺鲃仔魚的補償生長、消化酶活性及餌料日轉(zhuǎn)化率的影響

李忠利，蔣天勇，巴家文，蔡紅艷，黃 輝

(1.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)水產(chǎn)系，重慶 402460)

在人工養(yǎng)殖或天然環(huán)境條件下，開口仔魚受環(huán)境變化、季節(jié)更替和種內(nèi)種間競爭的影響，都可能因餌料缺乏而造成饑餓脅迫，其自身的代謝、行為也會發(fā)生相應(yīng)變化[1-2]。仔魚在饑餓時一般通過降低代謝水平、調(diào)整能量分配和消耗自身儲能物質(zhì)等來適應(yīng)，主要體現(xiàn)在自身蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等含量的變化，使得仔魚生長發(fā)育延遲，且不同種類在饑餓時其耐受能力與補償方式各不相同[3-5]。當(dāng)餌料恢復(fù)后，仔魚又會因饑餓程度的不同而表現(xiàn)出不同的補償生長現(xiàn)象。

早期仔魚死亡的主要原因與饑餓、開口攝食時間、敵害生物和疾病等因素有關(guān)，其中因開口攝食時間的推遲而導(dǎo)致的高死亡率表現(xiàn)尤為明顯。當(dāng)前有關(guān)鯉形目仔魚延遲首次投喂方面的報道有黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)、巖原鯉(Procyprisrabaudi)和厚頜魴(Megalobramapellegrini)等，主要針對仔魚骨骼肌、消化系統(tǒng)、消化酶活性的變化[4-7]，而對仔魚生長及餌料日轉(zhuǎn)化率的報道較少。對于開口仔魚而言，消化酶在促進仔魚代謝、存活和生長等方面的作用至關(guān)重要，其活力的強弱直接影響到仔魚的消化機能與調(diào)節(jié)機制[1,8-10]。本研究通過研究延遲首次投喂條件下烏江中華倒刺鲃仔魚消化酶的變化，一方面探討?zhàn)囸I再投喂對開口仔魚消化機能的影響，分析開口仔魚在補償生長下的消化酶應(yīng)對機制，為鯉科魚類仔魚的消化生理補充基礎(chǔ)資料；另一方面為養(yǎng)殖魚類人工育苗階段的營養(yǎng)配方及餌料投喂模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 仔魚獲取

初孵烏江中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)仔魚材料于2018年6月采自烏江彭水魚類人工增殖放流站，產(chǎn)自同一尾親魚。親魚用催產(chǎn)藥物HCG和AHRH-A2合劑催產(chǎn)，通過人工受精獲得受精卵，采用微流水孵化，經(jīng)過約80 h全部出膜，隨即帶回實驗室暫養(yǎng)于3個白色塑料水簇箱中(50 cm×35 cm×30 cm)。

1.2 實驗設(shè)計

仔魚自8日齡腸道貫通(以肛門處糞便為依據(jù))開始實驗，選擇體表正常的仔魚移入1 L玻璃水簇箱中，每箱(即1個重復(fù))60尾。實驗共設(shè)計H0(即正常投喂組)、H1(延遲1天再開始投喂，以下類推)、H3、H5、H7、H9和H11共7個處理組(當(dāng)仔魚PNR點，即13 d后停止分組)，每組3個重復(fù)。隨后進行再投喂實驗，投喂時間均為17 d。

實驗期間每天8:00、12:00和18:00各投餌一次，餌料為人工孵化的豐年蟲(Artemiasinica)無節(jié)幼體(山東濱州尚嘉水族提供，粗蛋白約60%，粗脂肪約20%，粗灰分約7%)。先用過濾網(wǎng)濾掉多余水分，用刻度吸管吸取后投喂，以箱中無殘餌為限，記錄每次實際投喂量。每天早上采用曝氣自來水換水一次,水溫(26.1±1.3)℃、溶氧(8.12±0.56)mg/L、pH值7.95±0.13，氨氮(0.32±0.8)mg/L，換水量為總量的1/2。

1.3 取樣與指標(biāo)測定

全長、體重測定：各實驗組每間隔4 d測量一次數(shù)據(jù)，各水簇箱隨機抽取10尾測量全長(0.1 mm)，稱量體重(0.1 mg，每次取10尾，各取樣3次)。

粗酶液制備：對仔魚整魚取樣，將上述稱量好的材料置于離心管中，加入4 ℃生理鹽水(重量∶體積=1∶9)，冰水浴剪碎、勻漿，3 000 r/min冷凍離心10 min，取組織勻漿上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

消化酶測定：按照南京建成生物工程研究所試劑盒的方法，用紫外分光光度計(Alpha-1860A)測定蛋白含量(貨號A045-2)、堿性磷酸酶(貨號A059-1)、淀粉酶(貨號C016-1)、脂肪酶(貨號A054-1)和胰蛋白酶活力(貨號A-080-2)。當(dāng)天未能即時測定樣本放置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

酶活力單位的定義如下，胃蛋白酶活性為每mg組織蛋白在37 ℃每分鐘分解蛋白質(zhì)生成1 μg酪氨酸相當(dāng)于1個酶活力單位；淀粉酶活性為組織中每mg蛋白在37 ℃最適pH與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位；胰蛋白酶活性為每mg組織蛋白在37 ℃每分鐘分解蛋白質(zhì)生成1 μg酪氨酸相當(dāng)于1個酶活力單位；脂肪酶活性為在37 ℃最適pH條件下，每g脂肪蛋白在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)的計算與分析

初次攝食率：FFR=100%×N2/N1；

即時死亡率：IMR=100%×N4/N3；

餌料日轉(zhuǎn)化率：DFCE=100%×(W2-W1)/[C×(t2-t1)]；

特定生長率：SGR=(lnM2-lnM1)/(t2-t1)；

式中，N2和N1分別為初次投喂時攝食仔魚尾數(shù)和取樣尾數(shù)(尾)；N4和N3分別為初次投喂前，死亡的仔魚尾數(shù)和各組仔魚總尾數(shù)(尾)；W2、W1分別代表t2、t1日齡時的魚體濕重(g)，C為攝食的餌料濕重(g)；M2和M1分別為時間t2、t1時的全長(mm)或體重(g)。

全長、體重損失率和補償率計算公式如下：

損失率：LR=(M0-M1)/M0×100%；

補償率：CR=(N6-N5)/N5×100%；

其中M0和M1分別代表各組饑餓開始和饑餓結(jié)束時的全長(mm)或體重(g)，N6和N5分別代表各組再投喂結(jié)束和再投喂開始(即饑餓結(jié)束)時的全長(mm)或體重(g)。

用Microsoft Excel 2010和Spss Satistics 17.0對數(shù)據(jù)進行整理、統(tǒng)計分析并作圖，各實驗組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行比較，當(dāng)差異顯著時則進行多重比較(Duncan’s multiple range tests),顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 全長和體重的損失與補償

各實驗組初次攝食率、即時死亡率、全長與體重的損失率、補償率見表1。初次攝食率隨饑餓時間的延長而逐漸減少，即時死亡率隨饑餓時間的延長而增加，從H5開始仔魚明顯消瘦、膽囊膨大，且H9和H11出現(xiàn)胸角。全長和體重的損失率都呈上升變化趨勢，各組間差異顯著。全長的補償率為18.9%～22.2%，除H9與H11外，其余各組間差異不顯著；體重補償率為64.1%～69.8%，除H1與H3外，其余各組間差異不顯著。

表1 各組饑餓及再投喂后全長和體重的損失率和補償率Fig.1 Loss rate and compensation rate of total length and body weight after starvation and re-feeding in each group of S.sinensis %

2.2 補償生長

各組在饑餓及再投喂17 d后的全長和體重變化見圖1。正常組H0的全長和體重都呈上升趨勢。各實驗組饑餓處理后的全長和體重都呈下降趨勢，且與正常組都存在顯著性差異。各實驗組再投喂后全長的補償生長曲線呈明顯下降趨勢，與對應(yīng)時間點的正常組比較，除H1差異不顯著外，其余各組都存在顯著性差異。體重的補償生長曲線先上升后下降，且與正常組都存在顯著性差異。

各組特定生長率的變化見圖2。正常組H0的全長和體重特定生長率都呈波動性變化趨勢，先呈波動性上升，分別在7 d和9 d時達到最大值，隨后為波動性下降。各實驗組再投喂后全長和體重的特定生長率與正常組都存在顯著性差異，在全長的變化中，H1、H3和H5呈先上升后下降的趨勢，H7、H9和H11呈先下降后上升的趨勢；在體重的變化中，H1先上升后下降，其余各組都呈下降趨勢。實驗后期，除H1和H3的體重外，其余各組全長和體重的特定生長率都明顯高于正常組。

圖1 各組全長和體重的補償生長Fig.1 Compensatory growth of total length and body weight in each group of S.sinensis

圖2 各組全長和體重特定生長率的變化Fig.2 Specific growth rate of total length and body weight in each group of S.sinensis

2.3 消化酶的變化

各組在饑餓及再投喂17 d后消化酶的的變化情況見圖3。正常組除了淀粉酶呈下降趨勢外，堿性磷酸酶、胰蛋白酶和脂肪酶都呈上升變化趨勢。饑餓處理中，淀粉酶、堿性磷酸酶和胰蛋白酶都呈下降趨勢，脂肪酶從H1至H7組呈上升趨勢，隨后在H9和H11組下降。再投喂后，除了淀粉酶呈先上升后下降趨勢外，其余三種酶都呈上升趨勢。

再投喂后，各實驗組間的比較結(jié)果顯示，四種消化酶比活力在正常投喂與再投喂間差異都不顯著。而在饑餓處理下，四種消化酶比活力在早期與正常投喂或再投喂的差異不顯著，在后期除了淀粉酶、堿性磷酸酶和胰蛋白酶組的H1和H3，脂肪酶組的H1至H7外，其余各組均差異顯著。

2.4 餌料日轉(zhuǎn)化率的變化

對不同恢復(fù)投餌天數(shù)下的餌料日轉(zhuǎn)化率進行了統(tǒng)計。實驗結(jié)束時各實驗組間的餌料日轉(zhuǎn)化率無顯著性差異，而與各自對應(yīng)的正常組相比都存在顯著性差異(見表2)。餌料日轉(zhuǎn)化率的變化見圖4，正常組在實驗期間的餌料日轉(zhuǎn)化率為0.010 %～0.044 %(平均0.027%±0.011%)，且隨實驗天數(shù)的增加呈不規(guī)則的波動上升趨勢。各實驗組在再投喂下的餌料日轉(zhuǎn)化率范圍均在0.004%～0.015%，顯著小于對應(yīng)的正常組，各組內(nèi)餌料日轉(zhuǎn)化率呈不規(guī)則上升的變化趨勢，但都無法恢復(fù)到正常投喂的水平。

圖3 各組消化酶活性的變化

表2 各組實驗結(jié)束時的餌料日轉(zhuǎn)化率Tab.2 Daily conversion rate of bait of each group at the end of experiment %

注：同一列中不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同上標(biāo)字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 延遲首次投喂對仔魚消化酶活力的影響

饑餓脅迫是魚類在早期生活史中面臨的主要問題之一，而消化酶的調(diào)節(jié)是開口仔魚應(yīng)對饑餓環(huán)境的主要方式[1,5]。不同的魚類調(diào)節(jié)過程各不相同，在已報道的鯉形目魚類中，厚頜魴饑餓仔魚通過增強脂肪酶比活力，消耗機體脂肪來補充個體所需[8]。王川等[5]研究發(fā)現(xiàn)胭脂魚仔魚在饑餓初期胰蛋白酶和脂肪酶活性呈上升趨勢。即在饑餓條件下，仔魚的消化酶仍具有活性，這一點在本研究的四種酶中都有體現(xiàn)，劉亞秋等[10]認為這主要受基因調(diào)控的影響，而非外源餌料誘導(dǎo)。四種酶中，僅脂肪酶活力在饑餓早期表現(xiàn)出波動性上升趨勢，之后呈下降趨勢，而其余三種酶都呈下降趨勢，這可能與仔魚自身攝入的食物量及可溶性蛋白的沉積有關(guān)[11]。

圖4 各組餌料日轉(zhuǎn)化率的變化Fig.4 Changes of daily food conversion rate in each group of S.sinensis

饑餓后再投喂下仔魚消化酶的特征也各不相同，王川等[5]研究發(fā)現(xiàn)胭脂魚仔魚的胰蛋白酶呈先上升后下降的趨勢，而淀粉酶活性與之相反，并指出仔魚的饑餓恢復(fù)策略與饑餓程度和恢復(fù)時間有關(guān)，饑餓時間越長胭脂魚仔魚的淀粉酶活性越強。本研究結(jié)果與胭脂魚剛好相反，除了淀粉酶活性下降外，其余酶活性在恢復(fù)攝食后都呈上升趨勢，這可能與不同種類的消化系統(tǒng)差別有關(guān)。

本研究中，中華倒刺鲃開口仔魚在正常攝食、饑餓以及再投喂條件下，仔魚消化酶都具有活性，并且表現(xiàn)出波動性變化特征。Cahu等[12]和Cara等[1]認為仔魚這種波動主要由遺傳因素決定，同時也受自身消化器官發(fā)育程度和環(huán)境中餌料數(shù)量及營養(yǎng)成分的影響。劉亞秋等[10]在西江鯉(Cyprinuscarpio)的仔魚研究中認為這是仔魚消化功能逐步適應(yīng)并完善的過程。

3.2 延遲首次投喂下仔魚的補償生長

謝小軍等[3]歸納了饑餓再投餌和正常投餌下魚體的生長差異，將補償生長分為超補償、完全補償、部分補償和不能補償四種類型。即使在鯉形目魚類中，延遲首次投喂下開口仔魚也表現(xiàn)出不同的生長特點，巖原鯉和胭脂魚饑餓3 d及以內(nèi)的仔魚在恢復(fù)投喂后，其體重均能顯示出完全補償生長，隨后表現(xiàn)為部分補償生長(巖原鯉4 d、胭脂魚8 d)，且仔魚隨饑餓時間的延長，其補償生長能力逐漸下降[4,5]。Mookerji等[13]也發(fā)現(xiàn)南亞野鯪(Labeorohita)仔魚在延遲首次投喂5 d后體重增值和存活率才明顯下降，而本研究結(jié)果顯示中華倒刺鲃仔魚的顯著變化時間稍晚(7 d)，其全長和體重都隨再投喂時間的延長而呈下降趨勢，特定生長率的上升變化趨勢顯示該魚饑餓再投喂后能完成部分補償生長，這可能是饑餓達到一定程度后，仔魚自身的消化酶活性顯著降低，此時即使補充投餌，其消化能力也無法維持自身物質(zhì)和能量的需求，從而無法恢復(fù)到正常水平[14]。而厚頜魴的補償生長效果更明顯，李芹等[8]發(fā)現(xiàn)該魚饑餓3天內(nèi)恢復(fù)投喂能表現(xiàn)出超補償生長現(xiàn)象，并認為這與不同階段魚體的發(fā)育狀況、食性及餌料質(zhì)量有關(guān)。而有關(guān)補償生長機制主要有代謝滯后假說、食欲增強假說和綜合作用假說三種[15]，多數(shù)報道更傾向于第三種，即仔魚在恢復(fù)投喂后不僅增強了食欲，提高了攝食水平，同時也增強了代謝，改善了食物轉(zhuǎn)化率。

3.3 延遲首次投喂下仔魚的攝食和存活

饑餓狀態(tài)下，魚類通過改變一些重要酶的活性，分解體內(nèi)儲能物質(zhì)來維持生命活動，以此對新陳代謝進行調(diào)節(jié)，對機體起到保護作用。對開口仔魚而言，在最佳的開口時間內(nèi)投餌能保證仔魚有較高的成活率，也能保證仔魚正常的生長發(fā)育[7,9,16]。延遲首次投喂實驗為仔魚的開口投喂時間提供了理論參考，在短期饑餓情況下，仔魚一般都能通過消耗自身機體物質(zhì)，以完成補償生長，但饑餓時間越長，其補償能力越弱，當(dāng)達到PNR點之后將逐漸趨于死亡[5,17-18]。本研究中，盡管各饑餓處理下仔魚的餌料日轉(zhuǎn)化率在恢復(fù)投喂后都能表現(xiàn)出一定程度的恢復(fù)，但都無法恢復(fù)到正常投喂水平，其餌料轉(zhuǎn)化能力明顯降低。

初次外源攝食時間對仔魚生長發(fā)育有著顯著影響，隨著首次投喂時間的延遲，仔魚表現(xiàn)出明顯的生長減緩、個體萎縮、器官退化和死亡率升高等特征[6,15,19-20]。在人工育苗過程中，把握好開口投喂時間，對于早期仔魚消化酶的形成和功能的完善，對仔魚消化吸收能力、個體生長發(fā)育有著極為重要的作用。