基于線粒體D-loop的西江流域粗唇鮠群體遺傳多樣性分析

彭 敏，韓耀全，吳偉軍，李育森，施 軍，王大鵬，雷建軍，何安尤

(廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西壯族自治區(qū)遺傳育種及健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021)

粗唇鮠(Leiocassiscrassilabris)隸屬鲇形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae)鮠屬(Leiocassis)，常棲息于江河、湖泊的底層草叢和巖洞內(nèi)，為底棲肉食性小型經(jīng)濟(jì)魚類，白天極少活動(dòng)，夜間外出覓食，以底棲生物，小魚和小蝦為食。在中國(guó)廣泛分布于長(zhǎng)江、珠江、閩江等水系。因其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，無肌間刺，食用價(jià)值較高而深受消費(fèi)者喜愛。近年調(diào)查發(fā)現(xiàn)西江主要干支流，粗唇鮠的捕獲量有明顯下降趨勢(shì)。粗唇鮠資源量的降低，預(yù)示著有效繁殖群體變小，這有可能造成性別失衡、遺傳漂變、遺傳多樣性丟失等現(xiàn)象。陳鋒等[1]在2013年對(duì)珠江龍灘庫尾至長(zhǎng)洲壩下江段干支流魚類調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，由于生境的改變，河口型魚類分布范圍變窄、珍稀瀕危特有魚類種群規(guī)模變小、流水性魚類資源量顯著下降；徐田振等[2]在2012-2013年在郁江金陵江段開展了漂流性魚卵的調(diào)查監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與歷史資料相比，郁江魚類產(chǎn)卵場(chǎng)功能發(fā)生較大變化，部分魚類產(chǎn)卵場(chǎng)消失，部分魚類雖然還能自然補(bǔ)充，但資源量較小。表明河流生境的變化及現(xiàn)行的過度捕撈等因素對(duì)魚類群落結(jié)構(gòu)及早期資源的補(bǔ)充會(huì)造成很大的影響。

線粒體DNA因具有母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，常被用于研究群體親緣關(guān)系。粗唇鮠線粒體全基因組包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因和1個(gè)非編碼區(qū)(D-loop)[3]，其中D-loop更是魚類群體遺傳學(xué)研究的常用材料。如李珊[4]對(duì)清水江的斑鱖(Sinipercascherzeri)種群遺傳分析發(fā)現(xiàn)其遺傳變異程度不高，遺傳多樣性豐富，種群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；侯新遠(yuǎn)等[5]對(duì)我國(guó)5種蝦虎魚類進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，描繪其親源關(guān)系的遠(yuǎn)近；董微微等[6]對(duì)長(zhǎng)江流域異鰾鰍鮀(Xenophysogobioboulengeri)的遺傳分析，推測(cè)其種群擴(kuò)張時(shí)間大概為0.017 3 Ma，均采用線粒體DNA的D-loop序列作為研究對(duì)象。劉偉等[7]亦曾使用D-loop序列對(duì)貴州都柳江段的粗唇鮠群體種群遺傳多樣性進(jìn)行了相關(guān)研究，然而廣度較小。粗唇鮠作為西江流域廣西境內(nèi)江段的重要經(jīng)濟(jì)魚類之一，在廣西各江段群體中遺傳多樣性如何，是否發(fā)生遺傳漂變迄今未見報(bào)道，這對(duì)廣西境內(nèi)粗唇鮠的種質(zhì)資源監(jiān)測(cè)及保護(hù)理論的構(gòu)建是有所欠缺的。本研究通過對(duì)西江流域廣西境內(nèi)7條江段的粗唇鮠群體分別進(jìn)行mtDNA D-loop 序列測(cè)定，旨在了解其遺傳結(jié)構(gòu)，分析其不同江段群體的遺傳分化程度和基因交流情況，為西江水系粗唇鮠自然種群的合理開發(fā)利用提供參考，為粗唇鮠種質(zhì)資源恢復(fù)與可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用粗唇鮠樣本共227尾，于2014年6月至2016年12月，分別采自西江流域7段支流或干流，其中都柳江(DLJ)廣西段(S1)31尾，紅水河(HSH)江段(S2)30尾，柳江(LIUJ)段(S3)50尾，西江(XIJ)段(S4)29尾，右江(YOUJ)段(S5)30尾，郁江(YUJ)段(S6)27尾，左江(ZJ)段(S7)30尾(圖1)。材料取自新鮮個(gè)體背部肌肉，每尾5 g，分別用95%酒精保存?zhèn)溆?，前兩天每天更換酒精一次。

圖1 粗唇鮠采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling site of L.crassilabris

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

粗唇鮠的總DNA采用醋酸銨法提取[8]，采用微量核酸蛋白分析儀測(cè)量DNA濃度和純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，經(jīng)檢測(cè)合格的DNA模板保存于-20 ℃冰箱備用。

粗唇鮠的D-loop序列擴(kuò)增采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的D-loop通用引物，序列為D-loop-F(5′-ACC CCT GGC TCC CAA AGC-3′)和D-loop-R(5′-ATC TTA GCA TCT TCA GTG-3′)[9]。

PCR反應(yīng)體系50.0 μL，包括2×Ex Taq Bufffer 25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各2 μL，100 ng/μL DNA模板2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)至50.0 μL。退火溫度為54.0 ℃。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由深圳華大基因公司正向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序所得序列采用clustalw軟件并輔以人工校對(duì)調(diào)整，堿基含量及變異位點(diǎn)采用MEGA 4.1軟件分析，計(jì)算Kimura 2-parameter遺傳距離，并以長(zhǎng)吻鮠(GenBank登錄號(hào)：GU596454.1)為外類群構(gòu)建單倍型的NJ系統(tǒng)樹。利用DnsSP 5.10軟件統(tǒng)計(jì)單倍型及計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。采用Arlequin軟件進(jìn)行分子方差分析，評(píng)估種群的遺傳分化程度，采用Tajima’s D和Fu′s Fs中性檢驗(yàn)估測(cè)有效種群大小的歷史。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D-loop堿基組成

獲得的粗唇鮠D-loop序列長(zhǎng)度均為666 bp，堿基T、C、A、G的平均含量為32.9%、23.3%、29.4%、14.4%，其中A+T(62.3%)明顯高于C+G(37.7%)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的堿基偏倚性，與一般脊椎動(dòng)物線粒體DNA序列特征相一致。

2.2 遺傳多樣性分析

粗唇鮠D-loop序列均未檢測(cè)到插入或缺失位點(diǎn)，檢測(cè)到變異位點(diǎn)6個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的0.90%，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)2個(gè)，單一變異位點(diǎn)4個(gè)；DLJ、LIUJ、YUJ、ZJ4個(gè)群體未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，HSH江段1個(gè)，YOUJ段2個(gè)，XIJ段5個(gè)。轉(zhuǎn)顛換比值R趨于無窮大，說明此基因序列突變未達(dá)到飽和狀態(tài)，受進(jìn)化噪音的影響可能性較小(表1)。在DAMBE進(jìn)行DNA序列替換飽和性檢驗(yàn)中，Iss=0.004 2，Iss.c=0.774 8，Iss

7個(gè)江段的粗唇鮠無論是單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均表現(xiàn)出較低的整體特征。整體單倍型多樣性指數(shù)為0.052 24，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 11。其中，單倍型多樣性指數(shù)與核苷酸多樣性指數(shù)均為XIJ群體最高，分別為0.199 51、0.000 52；DLJ、LIUJ、YUJ和ZJ群體最低，均為0.000 00。平均核苷酸差異最大為XIJ，為0.344 83，其次為YOUJ，為0.133 33(表1)。

227尾個(gè)體共檢測(cè)出6種單倍型，即hap1～hap6，其中hap1為優(yōu)勢(shì)單倍型，在所有群體均有出現(xiàn)，占總個(gè)體數(shù)的97.36%；hap3僅存在于XIJ與YOUJ群體；有4種單倍型為不同江段群體獨(dú)享，其中hap2為HSH獨(dú)享，hap4、hap5為XIJ獨(dú)享，hap6為YOUJ獨(dú)享(圖2)。

表1 粗唇鮠7個(gè)群體遺傳多樣性指數(shù)Tab.1 Genetic diversity index among seven populations of L.crassilabris

圖2 粗唇鮠NJ單倍型系統(tǒng)樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of L.crassilabris

2.3 粗唇鮠群體遺傳分化

2.3.1 種群遺傳距離

MEGA4.1軟件分析測(cè)序結(jié)果表明，粗唇鮠群體內(nèi)的遺傳距離在0.000 00～0.000 52之間。其中XIJ群體內(nèi)的遺傳距離最遠(yuǎn)為0.000 52；其次為YOUJ，為0.000 20；HSH為0.000 10；而其余4個(gè)江段群體內(nèi)的遺傳距離均為0.000 00。各群體間的遺傳距離在0.000 00～0.000 36之間，XIJ與其他幾個(gè)江段群體間的距離均較遠(yuǎn)，與YOUJ最遠(yuǎn)為0.000 36，其次與HSH群體，為0.000 31，與YUJ、ZJ、LIUJ、都LIUJ群體間的遺傳距離均為0.000 26(表2)。

2.3.2 種群遺傳分化系數(shù)

7個(gè)江段粗唇鮠群體之間的遺傳分化系數(shù)在-0.010 62～0.019 77之間，XIJ與LIUJ群體的遺傳分化系數(shù)最大，為0.01977；其次為L(zhǎng)IUJ與HSH/YOUJ群體的遺傳分化系數(shù)均為0.017 84；而HSH與XIJ/YUJ群體之間，XIJ與YOUJ/YUJ群體之間，YOUJ與YUJ群體之間的遺傳分化程度小且為負(fù)值。

群體間和群體內(nèi)的分子變異分析結(jié)果顯示，群體間的遺傳分化系數(shù)Fst=0.001 30；而且變異幾乎均來自群體內(nèi)部，群體間的變異占0.13%,群體內(nèi)占99.87% ，整個(gè)調(diào)查群體基因流Nm=384.1154(表2、表3)。

表2 粗唇鮠群體遺傳距離與FstTab.2 Genetic distance and genetic differentiation coefficient Fst of L.crassilabris

注：對(duì)角線為群體內(nèi)遺傳距離，對(duì)角線上方為遺傳分化系數(shù)Fst，對(duì)角線下方為群體間遺傳距離。

表3 粗唇鮠群體間和群體內(nèi)的分子變異分析(AMOVA)Tab.3 Analysis of interspecific and intraspecific molecular variation of L.crassilabris(AMOVA)

2.4 群體動(dòng)態(tài)分析

無限突變位點(diǎn)模型的中性檢驗(yàn)值Fu’s Fs 檢驗(yàn)結(jié)果表明，Tajima’s D(-1.857 04,0.000 00,P<0.01)、Fu′s Fs(-9.875 96,0.000 00,P<0.01)均為顯著負(fù)值，同時(shí)核苷酸錯(cuò)配分布結(jié)果顯示，粗唇鮠種群?jiǎn)伪缎秃蛪A基差異呈單峰分布，表明粗唇鮠種群近期經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件(圖3)。

根據(jù)公式τ=2ut計(jì)算XIJ水系粗唇鮠種群的大約擴(kuò)張時(shí)間，參照鲿科魚類的線粒體DNA進(jìn)化速率約為0.18%～0.30%/Ma[10]，而粗唇鮠性成熟最早為2齡，通過AMOVA分析表明τ=3.000，因此推測(cè)本次調(diào)查的粗唇鮠群體基于D-loop基因序列的擴(kuò)張時(shí)間可能是在距今0.75～1.25 Ma前。

圖3 粗唇鮠核苷酸錯(cuò)配分布圖Fig.3 Mismatch distribution of L.crassilabris

3 討論

3.1 粗唇鮠的遺傳多樣性

3.1.1 D-loop結(jié)構(gòu)與變異性

7個(gè)江段的粗唇鮠D-loop序列長(zhǎng)度均為666 bp，表現(xiàn)出較強(qiáng)的堿基偏倚性，與一般脊椎動(dòng)物線粒體DNA序列特征相一致。堿基轉(zhuǎn)顛換比值R趨于無窮大，說明此基因序列突變未達(dá)到飽和狀態(tài)，受進(jìn)化噪音的影響可能性較小，Wolstenhome等[11]認(rèn)為，轉(zhuǎn)顛換的偏倚性可能與序列間的差異存在著一定的相關(guān)性，即轉(zhuǎn)顛換的比率與物種從共同祖先進(jìn)化的時(shí)間成反比，由此可以推斷XIJ流域的粗唇鮠有效種群是在近期由單一、少數(shù)的種群建立的。

3.1.2 遺傳多樣性指數(shù)分析

單倍型多樣性指數(shù)Hd和核苷酸多樣性指數(shù)π是評(píng)估遺傳多樣性的兩個(gè)重要參數(shù)[12]。本研究中7個(gè)江段群體中，XIJ群體單倍型多樣性指數(shù)與核苷酸多樣性指數(shù)均為最高，平均核苷酸差異最大，LIUJ、LIUJ、YUJ和ZJ群體各多樣性指數(shù)最低，核苷酸差異最小，整體呈現(xiàn)下游高于上游，南方高于北方的現(xiàn)象。這與白曉慧等[13]對(duì)天津5個(gè)大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)自然群體的研究結(jié)果較為一致。粗唇鮠整體單倍型多樣性指數(shù)為0.052 24，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 11，遠(yuǎn)低于珠江水系的其他魚類，如底棲肉食性魚類黃顙魚(Pelteobagrusfulvidrac)群體(Hd=0.721～0.911，π=0.002 2～0.046 89)[14]、中上層雜食性魚類赤眼鱒(SpualiobarbusCurriculus)群體(Hd=0.700 0～1.000 0，π=0.011 3～0.013 7)[15]、中下層雜食性魚類鯪(Cirrhinamolitorella)群體(Hd=0.826，π=0.003 32)[16]和中下層肉食性魚類鱖魚(Hd=0.773，π=0.001 95)[17]。程丹汝等[18]在研究銅陵順安河中不同種類魚體內(nèi)磺胺類抗生素累積中發(fā)現(xiàn)，在7種不同的魚類中，7種磺胺類抗生素的濃度水平在粗唇鮠體內(nèi)含量最高；Li等[19]亦曾報(bào)道肉食性、底棲性魚類在大壩蓄水后汞的生物累積高于其他魚類。這在一定程度上可推測(cè)底棲肉食性魚類的粗唇鮠相比于其他魚類可能更容易受環(huán)境污染的影響，因此推斷環(huán)境污染可能是粗唇鮠資源量下降，遺傳多樣性丟失的其中一個(gè)原因。一個(gè)物種遺傳多樣性的高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。遺傳多樣性為物種的適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化能力提供了潛在的遺傳基礎(chǔ)和儲(chǔ)備。物種遺傳多樣性越豐富，其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力越大；遺傳多樣性的降低可導(dǎo)致其適應(yīng)能力和生存能力降低、物種退化甚至威脅物種生存[20]。本次調(diào)查的粗唇鮠群體單倍型多樣性指數(shù)與核苷酸多樣性指數(shù)遠(yuǎn)低于DLJ易危物種小口白甲魚(Hd=0.260，π=0.005 75)[21]，說明粗唇鮠種群的保護(hù)與恢復(fù)應(yīng)受到重視。

3.2 粗唇鮠的遺傳變異分析

單倍型之間的遺傳距離是衡量一個(gè)物種或群體的mtDNA變異程度的重要指標(biāo)，遺傳距離越大表明群體間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)[22]。本次調(diào)查粗唇鮠群體內(nèi)的遺傳距離在0.000 00～0.000 52之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到種群劃分的界限，表明調(diào)查的7個(gè)江段粗唇鮠群體具有較近的親緣關(guān)系，無明顯的種群分化，可能是處于同一水系的粗唇鮠群體有遷移習(xí)性形成基因交流所致。與熊美華等[23]對(duì)長(zhǎng)江向家壩上、下圓口銅魚(Coreiusguichenoti)群體的遺傳分化調(diào)查結(jié)果相似，表明大壩并不能阻礙所有魚類的基因交流。

Wright按照遺傳分化指數(shù)的大小提出了遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)(Fst<0.05，無遺傳分化；0.05< Fst <0.15，較小遺傳分化；0.150.25，遺傳分化較大)[24]。本研究中7個(gè)江段粗唇鮠群體間的遺傳分化系數(shù)在-0.010 62～0.019 77之間，再次證明群體間無遺傳分化。同時(shí)基因流 Nm=384.115 4，表明群體間基因交流非常充分，是一個(gè)隨機(jī)交配群體[25]，群體間基本不存在隔離和分化，應(yīng)當(dāng)被當(dāng)做一個(gè)種群來進(jìn)行開發(fā)利用。

NJ鄰接樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，粗唇鮠群體間不存在明顯的地理結(jié)構(gòu)和譜系結(jié)構(gòu)，另外，通過AMOVA分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)江段群體的遺傳變異系數(shù)Fst=0.001 30，群體間變異占0.13%，群體內(nèi)變異占99.87%，變異幾乎全部來自種群內(nèi)部?？赡苁荴IJ流域粗唇鮠種群最近發(fā)生過種群的瓶頸效應(yīng)或由單一、少數(shù)種群所產(chǎn)生的奠基者效應(yīng)。

3.3 粗唇鮠的種群動(dòng)態(tài)

Tajima’s D與Fu’s Fs值中性檢驗(yàn)常用于推測(cè)種群歷史發(fā)生，如果Tajima’s D與Fu’s Fs值呈負(fù)值，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到顯著標(biāo)準(zhǔn)，則說明序列中含有比中性進(jìn)化模型更多的核苷酸位點(diǎn)變化，可能預(yù)示著被研究種群曾經(jīng)經(jīng)歷過一個(gè)擴(kuò)張的歷史[26]。中性檢測(cè)結(jié)果表明，Tajima’s D、Fu’s Fs均為顯著負(fù)值，同時(shí)核苷酸錯(cuò)配分布結(jié)果呈單峰，故認(rèn)為粗唇鮠種群最近經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件，擴(kuò)張時(shí)間推測(cè)在距今0.75～1.25 Ma，與采用相同進(jìn)化速率推算出的鲇形目鲿科的黃顙魚(0.41～0.69 Ma年前)、光澤黃顙魚[27](0.51～0.86 Ma年前)擴(kuò)張時(shí)間相近。

3.4 保護(hù)建議

研究結(jié)果表明，本次調(diào)查江段的粗唇鮠群體遺傳多樣性水平較低，預(yù)示著其群體對(duì)復(fù)雜環(huán)境具有更差的適應(yīng)能力。因此，應(yīng)通過合理限制捕撈規(guī)格，加強(qiáng)禁漁期監(jiān)管，維持其野生資源的可持續(xù)性開發(fā)與利用；同時(shí)還可以考慮收集XIJ流域上游，如貴州、云南江段的親魚進(jìn)行人工繁育，并合理的增殖放流于廣XIJ段以增加其種群多樣性，若有必要還需實(shí)行捕撈限額制度或減少釣捕、并放生籠捕所獲得的小規(guī)格魚種，以促進(jìn)粗唇鮠種群的恢復(fù)與健康發(fā)展。