鵝乙酰輔酶A ?；D(zhuǎn)移酶1 基因的克隆、表達(dá)及生物信息分析

劉 毅，李光全， 龔紹明，何大乾

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 310029)

鵝肥肝是以特定的飼料和養(yǎng)殖技術(shù)促使鵝肝臟合成大量脂肪，并誘導(dǎo)肝臟中脂肪變性而形成的含有大量脂肪的鵝肝臟[1]。這種肥肝相當(dāng)于正常肝臟重量的5～10倍，因其質(zhì)地細(xì)嫩、風(fēng)味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，特別是不飽和脂肪酸含量極高，頗受人們青睞。鵝肝臟在調(diào)節(jié)脂肪代謝的能力表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性，其肥肝重量可以達(dá)到原來(lái)肝臟重量的10 倍以上，占其體重的10%[2]，并且這個(gè)過(guò)程是可逆的，當(dāng)肥肝形成以后，加以限制飼養(yǎng)，肝臟重量及其組成成分會(huì)恢復(fù)到填飼前的狀態(tài)[3-5]。近年來(lái)，有關(guān)鵝肥肝形成機(jī)理一直受到人們的關(guān)注，并利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，圍繞鵝肥肝形成的分子機(jī)制展開研究[6-8]，已成功篩選到與鵝肥肝形成相關(guān)的基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行功能研究。

乙酰輔酶A ?；D(zhuǎn)移酶（Cetyl-CoenzymeA Acyltransferas，ACAA）作為?；D(zhuǎn)移酶主要分布于線粒體內(nèi)，參與脂肪酸的合成、氧化和代謝等，是調(diào)節(jié)動(dòng)物肝臟中脂類代謝重要的功能基因。乙酰輔酶A ?；D(zhuǎn)移酶（ACAA）基因包括乙酰CoA ?；D(zhuǎn)移酶1（Cetyl-CoenzymeA Acyltransferas 1，ACAA1） 和 乙 酰 CoA酰基轉(zhuǎn)移酶2（ACAA2）2 種類型。有研究表明，ACAA1[9-10]和ACAA2[11-14]在動(dòng)物肝臟中長(zhǎng)鏈脂肪酸的代謝、脂肪酸的β氧化、膽汁酸代謝、膽固醇代謝過(guò)程發(fā)揮重要作用。王倩倩等[14]研究表明，ACAA2基因的表達(dá)與鵝肥肝的形成密切相關(guān)。但目前關(guān)于鵝ACAA1基因在鵝肥肝形成過(guò)程中的作用未見報(bào)道。

本研究選用朗德鵝為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)填飼和限飼獲得肥肝形成過(guò)程中不同階段的肥肝樣品，并采用RTPCR 和RACE 方法克隆獲得朗德鵝ACAA1基因cDNA全長(zhǎng)序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法檢測(cè)ACAA1基因在朗德鵝不同填飼階段肝臟中的表達(dá)，為深入研究ACAA1基因在鵝肥肝形成過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 朗德鵝選自江西南豐匯和有限公司，同批孵化且在相同的環(huán)境條件下飼養(yǎng)，選用體型和體重相當(dāng)?shù)?0 日齡健康朗德鵝42 只，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，并用蒸熟玉米（玉米，1% 植物油，1% 鹽）填飼，填飼到21 d 轉(zhuǎn)為限制飼養(yǎng)。分別在填飼前（OF0）、填飼第7 天（OF7）、填飼第14 天（OF14）、填飼第21天（OF21）、限制飼養(yǎng)第7 天（F7）、限制飼養(yǎng)第14天（F14）和限制飼養(yǎng)第21 天（F21）隨機(jī)選取6 只屠宰，快速收集肝組織，投入液氮中快速冷凍之后放置-80℃冰箱保存。

1.2 實(shí) 驗(yàn)材 料 總 RNA 提 取 試劑（TRIzol?Reagent） 購(gòu)于Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）、PCR 擴(kuò) 增 試 劑（TaKaRa LA Taq）、基因片段克隆載體（PMDTM19-T Vector Cloning Kit）、實(shí)時(shí)熒光定量試劑（SYBR Premix EX Taq）和DNA Marker購(gòu)于TaKaRa公司，RACE試劑（SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit）購(gòu)于Clontech 公司，瓊脂糖（Agarose）購(gòu)于Biowest 公司α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司，異丙基β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na2·H20）二甲基酰胺購(gòu)自成都博瑞克公司。PCR 產(chǎn)物回收試劑盒Gel Extraction Mini Kit 為OMEGA 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)鵝肝臟轉(zhuǎn)錄組拼接的ACAA1基因片段，設(shè)計(jì)3 對(duì)引物（表1），根據(jù)獲得的鵝ACAA1基因片段，分別設(shè)計(jì)5′和3′端巢式PCR 引物（表1），利用獲得的鵝ACAA1基因cDNA 序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物，以GAPDH為內(nèi)參，引物詳情見表1。

1.3.2ACAA1基因CDS 區(qū)的克隆 根據(jù)鵝肝臟轉(zhuǎn)錄組拼接的ACAA1基因片段，設(shè)計(jì)3 對(duì)引物（表1），PCR擴(kuò)增鵝ACAA1基因CDS 區(qū)的部分序列，PCR 反應(yīng)總體系為 50 μL：上、下游引物各 1.5 μL、2× Taq PCR Master Mix 25 μL、ddH2O 20 μL、cDNA 模 板 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、退火溫度 30 s、72℃ 1 min，34 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進(jìn)行目的片段純化回收，并將回收純化的目的片段連接到PMD19-T 克隆載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在平板上培養(yǎng)后挑出陽(yáng)性單菌落并接種于液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床中搖菌8 h，進(jìn)行菌液渾濁后進(jìn)行PCR 鑒定，挑選3 個(gè)陽(yáng)性克隆送往上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3ACAA1基因 RACE 克隆 根據(jù)根據(jù) ACAA1-1、ACAA1-2 和ACAA1-3 引物PCR 擴(kuò)增獲得的鵝ACAA1基因片段，分別設(shè)計(jì)5′和3′端巢式PCR 引物（表1），巢式 PCR 擴(kuò) 增鵝ACAA1基 因 5′ 和 3′ 端 完 整序 列。RACE cDNA 模板按照SMARTerTMRACE 試劑盒說(shuō)明制備獲得，PCR 反應(yīng)總體系為50 μL：10X Advantage 2 PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix 1 μL、50X Advantage 2 Polymerase Mix 1 μL、PCR-Grade Water 34.5 μL、UPM 5 μL、第 1 條引物 1 μL、cDNA 模板 2.5 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s、72℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s、70℃ 30 s、 72℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s、68℃ 30 s、72℃ 3 min，25 個(gè)循環(huán)。然后以第1 次PCR 產(chǎn)物為模板，用第2 條引物再重復(fù)1 次PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件與第一次PCR 相同，然后PCR 產(chǎn)物檢測(cè)、純化、克隆和測(cè)序。

表1 ACAA1 基因引物信息

1.3.4 熒光定量PCR 分析 利用上面獲得的鵝ACAA1基因cDNA 序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物，以GAPDH為內(nèi)參，參照 TAKARA SYBR?Premix Ex TaqTM II 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL 和 ddH2O 8.5 μL。上述體系密封后放入熒光定量PCR 儀中。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s。然后95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：95℃ 1 min，55℃ 1 min。然后從55℃開始，每個(gè)循環(huán)溫度增加0.5℃，時(shí)間為10 s，81 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由熔解曲線判定PCR 反應(yīng)的特異性，利用2-ΔΔCt計(jì)算ACAA1基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果利用NCBI 網(wǎng)站提供的同源比對(duì)服務(wù)器BLAST 進(jìn)行序列同源性分析。從NCBI 核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他動(dòng)物的ACAA1基因的核酸序列，利用DNAMAN（5.2.9）、Clustal X（1.83）軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，然后根據(jù)核酸序列多重比對(duì)的結(jié)果運(yùn)用MEGA4.0 繪制分子進(jìn)化樹。使用ExPASy 的在線軟件Compute pI/MW 分析ACAA1分子的等電點(diǎn)（pI）、理論分子量，利用ProtParam 在線工具推測(cè)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成，網(wǎng)址為http://au.ExPASy.org/tools/pi_tool.html；使用TMHMM 軟件分析ACAA 蛋白的跨膜區(qū)域（http://www.cbsdtu.d--k/services/TMHMM/）；使用HNN 軟件預(yù)測(cè)ACAA1 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（https://npsaprabi.ibcp.fr--/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsah-nn.html）；ACAA1 蛋白三維模型由SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）完成。

2 結(jié) 果

2.1 鵝ACAA1基因克隆 以朗德鵝肝臟cDNA 為模板，用 ACAA1-1、ACAA1-2 和 ACAA1-3 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得3 個(gè)單一條帶（圖1-A、B 和C），克隆測(cè)序比對(duì)分析，分別獲得706、724、510 bp 鵝ACAA1基因片段。用 5′ RACE 和 3′ RACE引物進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得2 條明顯的條帶（圖1-E 和D），克隆測(cè)序和比對(duì)分析，分別獲得756 bp 和828 bp 鵝ACAA1基因片段。

2.2 鵝ACAA1基因序列分析 測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN去除載體序列，拼接獲得鵝ACAA1基因完整的cDNA序列，共3 352 bp，采用ORF Finder 對(duì)ACAA1基因cDNA 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其包括CDS 區(qū)為1 323 bp，5'UTR長(zhǎng)度為77 bp，3'UTR 長(zhǎng)度為1 952 bp，編碼441 個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，3'UTR包括2 個(gè)保守的AATAAA 順序及poly（A）尾巴（圖2）。利用BLAST 進(jìn)行序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，鵝ACAA1 氨基酸序列與鳥類的ACAA1 氨基酸序列相似度最高。

利用ExpASy 上的ProtParam 軟件分析ACAA1 蛋白基本的理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)ACAA1蛋白的分子量為45.015ku，理論等電點(diǎn)為9.19。利用TMHMM 軟件進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)域分析： ACAA1 蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)，1～441 位氨基酸均位于細(xì)胞膜內(nèi)。

2.3 鵝ACAA1 氨基酸序列同源與進(jìn)化分析 氨基酸對(duì)比結(jié)果表明，與小鼠、大鼠、綿羊、原雞、鴻雁、人、豬、牛、狗的氨基酸同源性分別為86.9%、86.5%、86.9%、100%、93.0%、85.4%、85.2%、86.2%、85.6%。所有物種的同源率均超過(guò)了85%，說(shuō)明ACAA1 在進(jìn)化過(guò)程中非常保守。

進(jìn)化樹構(gòu)建的結(jié)果見圖3，本次預(yù)測(cè)的朗德鵝ACAA1 蛋白先與鴻雁匯集到一支，再與原雞聚成一支。在哺乳動(dòng)物里綿羊與牛先匯集成一支，再分別按順序單獨(dú)與豬、狗、人匯集。大鼠與小鼠單獨(dú)匯聚成一支。從分析結(jié)果可以看出，哺乳動(dòng)物與家禽之間差異很大，哺乳動(dòng)物里不同綱之間也有一定差異。

2.3 鵝ACAA1基因熒光定量分析 以鵝GAPDH基因表達(dá)量為參照，ACAA1基因在朗德鵝不同填飼階段肝臟中的表達(dá)量如圖4 所示，ACAA1基因在肝臟中的表達(dá)量隨著填飼時(shí)間的推移表達(dá)量逐步增加，在填飼14 d時(shí)表達(dá)量最高（P＜0.05），在填飼到第21 天，其表達(dá)量有所下降，在填飼結(jié)束限飼階段的鵝肝臟中表達(dá)最低（P＜0.05），限飼到21 d，其表達(dá)量恢復(fù)到填飼前水平。

3 討 論

ACAA 作為酰基轉(zhuǎn)移酶主要分布于線粒體內(nèi)，參與脂肪酸的合成、氧化和代謝等，是調(diào)節(jié)動(dòng)物肝臟中脂類代謝重要的功能基因。本研究采用RT-PCR 和RACE方法克隆獲得鵝ACAA1基因cDNA 全長(zhǎng)序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，鵝ACAA1基因cDNA 全長(zhǎng)為 3 352 bp，其中 CDS 區(qū)長(zhǎng)度為 1 323 bp，5'UTR 長(zhǎng)度為77 bp，3'UTR 長(zhǎng)度為1 952 bp，編碼441 個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，3'UTR 包括2 個(gè)保守的AATAAA 順序及poly（A）尾巴。比對(duì)結(jié)果表明，鵝ACAA1 氨基酸序列與鳥類的ACAA1 氨基酸序列相似度為95%～98%，說(shuō)明ACAA 氨基酸序列在鳥類同源性高，進(jìn)化過(guò)程中較保守。這與ACAA2[14]在鳥類中的同源分析結(jié)果類似。ACAA1 的氨基酸序列聚類分析結(jié)果和ACAA2[14]分析結(jié)果一致，鳥類聚為一支，其他哺乳動(dòng)物聚為一支，這可能與其在動(dòng)物生命活動(dòng)過(guò)程中所發(fā)揮的作用有關(guān)。

圖1 鵝ACAA1 基因PCR 擴(kuò)增片段電泳圖

圖2 鵝ACAA1 基因cDNA 序列與對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

圖3 ACAA1 的系統(tǒng)發(fā)生樹

圖4 不同時(shí)期ACAA1 基因的表達(dá)譜

在哺乳動(dòng)物的肝臟中，ACAA1 參與過(guò)氧化物酶體脂代謝，在動(dòng)物多不飽和脂肪酸（亞麻酸和亞油酸）合成和代謝中發(fā)揮重要作用[15]。ACAA 催化完成過(guò)氧化物酶體β- 氧化的最后一步[16]。另外，ACAA1 還是過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體α亞基（PPAR-α）的靶基因[17]，通過(guò)上調(diào)SREBP-2基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控PPAR-α的表達(dá)和功能[18]。本研究結(jié)果表明，ACAA1基因在肝臟中的表達(dá)量隨著填飼時(shí)間的推移，其表達(dá)量逐步增加，在填飼14 d 時(shí)表達(dá)量最高，與ACAA2基因在朗德鵝肥肝形成過(guò)程中表達(dá)模式基本一致[14]。以上研究結(jié)果表明，通過(guò)填飼可以增加鵝ACAA1和ACAA2的表達(dá)，與SREBP 協(xié)同作用，促進(jìn)肝臟合成大量脂肪酸。隨著填飼的繼續(xù)，ACAA1基因表達(dá)開始下降，在填飼結(jié)束限飼階段的鵝肝臟中表達(dá)最低，限飼到21 d，其表達(dá)量恢復(fù)到填飼前水平，這可能與肥肝形成之后，肝臟中脂肪酸的氧化減少相關(guān)。

綜上所述，本研究克隆獲得朗德鵝ACAA1基因cDNA 全長(zhǎng)序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢測(cè)ACAA1基因在朗德鵝不同填飼階段肝臟中的表達(dá)。結(jié)果表明，ACAA1基因的表達(dá)與鵝肥肝的形成密切相關(guān)，其作用機(jī)制還有待深入研究，為研究ACAA1基因在鵝肥肝形成中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。