復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清免疫球蛋白含量和特定糞便菌群的影響

陳國(guó)福，程皇座，麻名漢

（黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150038）

益生菌是“有益于宿主健康的活的微生物”[1]，益生菌到達(dá)宿主體內(nèi)可起到多種有益作用，包括抑制病原菌及條件致病菌的生長(zhǎng)、激發(fā)機(jī)體非特異性免疫、增強(qiáng)宿主黏膜免疫能力、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、改善機(jī)體健康狀況，且不產(chǎn)生藥物殘留及抗藥性等問(wèn)題[2]。因此，益生菌成為飼用抗生素的一種可替代產(chǎn)品。1947 年首次報(bào)道乳酸桿菌可改善仔豬的健康狀況，有效增加體重[3]。Schillinger 等[4]使用從肉制品分離篩選出的乳酸菌進(jìn)行體外模擬抗菌試驗(yàn)，得出乳酸菌可能具有預(yù)防消化道疾病，并且有助于提高生長(zhǎng)速度的結(jié)論。鄺哲師等[5]報(bào)道，在飼料中添加芽孢桿菌后，斷奶仔豬胃蛋白酶和胰淀粉酶活性分別增加58.68%和24.05%，回腸內(nèi)的蛋白酶和淀粉酶活性則分別增長(zhǎng)了61.0%和20.30%。因此，在無(wú)抗養(yǎng)殖背景下，選用益生菌制劑作為飼料添加劑，減量或者替代抗生素的使用是一種有效方法。本試驗(yàn)旨在評(píng)定復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血液免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響，為復(fù)合菌制劑替代抗生素的安全使用提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 復(fù)合益生菌制劑由植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和扣囊復(fù)膜孢酵母按體積1:1:1:1的比例復(fù)合，含總有效活菌數(shù)為9.8×109CFU/g（通過(guò)平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行微生物菌計(jì)數(shù)），由黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室制備提供。試驗(yàn)仔豬由黑龍江農(nóng)墾雁窩島釀酒有限公司提供。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將120 頭30 日齡、平均體重（7.50±0.50）kg 的杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬隨機(jī)分為4 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10 頭仔豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.01%硫酸粘桿菌素+0.04%安來(lái)霉素，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加0.10% 和0.20% 復(fù)合益生菌制劑。試驗(yàn)飼糧調(diào)制及其養(yǎng)分含量計(jì)算參照《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 65-2004）和《仔豬、生長(zhǎng)肥育豬配合飼料》（GB/T 5915-2008），飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。試驗(yàn)期40 d。仔豬在（28±2）日齡時(shí)斷奶并轉(zhuǎn)入高床保育舍，2 d 后開(kāi)始試驗(yàn)。試驗(yàn)開(kāi)始前，全面消毒豬舍，試驗(yàn)豬自由采食與飲水，有病豬出現(xiàn)及時(shí)救治，做好各項(xiàng)工作記錄，按照豬場(chǎng)正常程序進(jìn)行免疫與管理。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能 每頭豬在試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)結(jié)束空腹12 h后稱重，并記錄每天投料量，計(jì)算試驗(yàn)豬平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）。

1.3.2 腹瀉率 每天定時(shí)觀察與記錄豬群的排糞情況；記錄每一重復(fù)內(nèi)腹瀉個(gè)體數(shù)及腹瀉的持續(xù)時(shí)間。最后以重復(fù)為單位計(jì)算腹瀉頭數(shù)（即1 頭豬腹瀉1 d 記1 次腹瀉）。

腹瀉率= 腹瀉頭數(shù)/（試驗(yàn)天數(shù)× 試驗(yàn)頭數(shù)）×100%。

1.3.3 血液免疫指標(biāo) 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空腹稱重后每重復(fù)隨機(jī)選擇2 頭豬，用一次性注射器前腔靜脈采血6 mL，將血液沿管壁緩慢注入到己編號(hào)的EP 管中，3 500 r/min 離心10 min，分離血清于-20℃保存、待測(cè)。采用免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）試劑盒（浙江伊利康生物技術(shù)公司），免疫透射比濁法測(cè)定血清免疫球蛋白含量。

1.3.4 糞便菌群測(cè)定 飼養(yǎng)試驗(yàn)至30 d 時(shí)，早上每重復(fù)無(wú)污染地采集2 頭豬的新鮮糞便，放入標(biāo)好號(hào)碼的滅菌塑料瓶中，用帶有冷凍冰的泡沫箱裝存，立即送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。稱取0.5 g 糞便樣品于10 mL 滅菌的離心管中，用0.9%的生理鹽水4.5 mL 稀釋，搖勻即為10-1稀釋，依次進(jìn)行梯度稀釋到10-5～10-9，分別取0.1 mL稀釋液接種于MRS 瓊脂培養(yǎng)基的厭氧管中（測(cè)定乳酸桿菌數(shù)量）和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基的平皿上（測(cè)定大腸桿菌的數(shù)量），各稀釋度3 個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。菌群的數(shù)量以每克鮮豬糞樣中所含有的微生物的對(duì)數(shù)值（lg）表示（CFU/g）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 軟件進(jìn)行處理后，使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響 由表2 可知，與對(duì)照組相比，抗生素組和0.20%益生菌組ADG 均提高（P＜0.05），F(xiàn)/G 和腹瀉率均降低（P＜0.05），其中抗生素組、0.10%和0.20%益生菌組的ADG、ADFI、F/G 差異均不顯著，0.20% 益生菌組與抗生素組的ADG、F/G 和腹瀉率差異均不顯著。

2.2 復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，抗生素組、0.10%和0.20% 益生菌組IgG 含量分別提高了12.43%、12.23%和15.41%（P＜0.05），IgA 含量分別提高了11.23%、9.55%和 16.85%（P＜0.05）。

2.3 復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬糞便菌群的影響 由表4 可知，0.20%益生菌組糞便中大腸桿菌數(shù)與對(duì)照組、抗生素組和0.10%益生菌組差異顯著；與對(duì)照組相比，抗生素組、0.10%、0.20% 益生菌組乳酸桿菌數(shù)目分別提高了6.74%、7.35%、和9.68%（P＜0.05）。

3 討 論

斷奶仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中不可逾越的難題，通常認(rèn)為是由大腸桿菌感染和飼糧更改所致，引起仔豬分泌功能改變、腸道受損和腸道微生物區(qū)系紊亂[6]，進(jìn)而導(dǎo)致免疫機(jī)能降低，抗病力下降，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制[7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗生素組、0.10%和0.20%益生菌組的豬腹瀉率都顯著低于對(duì)照組，抗生素組豬的腹瀉率下降幅度最大，為51.79%，說(shuō)明理想的抗生素組合對(duì)預(yù)防豬的腹瀉確實(shí)有效果，但是0.20%復(fù)合益生菌制劑組也取得了降低48.20%的良好效果，二者的差別并不顯著，同時(shí)，本試驗(yàn)中，復(fù)合益生菌制劑按0.20%添加與抗生素獲得了相同的仔豬增重效果。馬曙生[8]采用EM菌發(fā)酵的飼料飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組仔豬的腹瀉率降低了65.6%，死亡率降低了6.8%；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組仔豬腹瀉率下降66.3%，ADG 提高18.6%。復(fù)合益生菌制劑預(yù)防腹瀉的機(jī)制可能是：①?gòu)?fù)合益生菌制劑可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，與腸道內(nèi)的有害細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)，能夠有效地抑制和殺滅腸道里的沙門(mén)氏菌和大腸桿菌，改善仔豬腸道內(nèi)的微生物區(qū)系，從而大大降低了仔豬腹瀉率的發(fā)生[9]；②復(fù)合益生菌制劑中的芽孢桿菌進(jìn)入腸道后迅速?gòu)?fù)活，在腸道后端大量裂殖，消耗腸道內(nèi)的氧，使大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等有害菌因缺氧而停止生長(zhǎng)，維持腸道內(nèi)的正常生態(tài)平衡[10]；③復(fù)合益生菌制劑中的乳酸桿菌大量繁殖，產(chǎn)生了有機(jī)酸，抑制了腸道內(nèi)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等繁殖，減少了飼料中的蛋白質(zhì)在大腸內(nèi)的腐敗，使有毒有害物質(zhì)氨氣、胺與內(nèi)毒素等的生成量大幅下降[11]；④復(fù)合益生菌制劑的應(yīng)用能夠使飼料中的大豆蛋白抗原物質(zhì)產(chǎn)生的過(guò)敏程度下降，能夠使仔豬的腹瀉率大大降低[12]。復(fù)合益生菌制劑能夠提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的原因可能是：①仔豬小腸的黏膜吸收功能受復(fù)合益生菌制劑的作用而增強(qiáng)，小腸內(nèi)絨毛變長(zhǎng)，隱窩深度下降，增強(qiáng)了動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[13]；②復(fù)合益生菌在斷奶仔豬的腸道中定植、繁殖，發(fā)酵產(chǎn)酸使腸道pH 下降，抑制和殺滅了病原菌大腸桿菌及沙門(mén)氏菌等，同時(shí)芽抱桿菌具有較高的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，對(duì)植物性的碳水化合物也能夠較好的降解，這些促進(jìn)了斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的發(fā)揮[14]。

表3 復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬血清免疫球蛋白含量的影響 g/L

表4 復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬糞便微生物菌群的影響 lg CFU/g

血清免疫球蛋白抗體IgM、IgA 與IgG 的提高，對(duì)動(dòng)物免疫機(jī)能的提升具有一定的意義。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，益生菌能夠提高斷奶仔豬血清IgA 與IgG 含量。這一結(jié)果同陳代文等[15]研究給斷奶仔豬飼喂添加益生素的飼料，仔豬的血清免疫抗體IgG、IgM和IgA 的水平提高和文靜等[16]發(fā)現(xiàn)在仔豬飼糧中添加屎腸球菌使血清中IgA 和IgG 的含量分別顯著提高了16.48% 和 25.43 的結(jié)果相似，這說(shuō)明復(fù)合菌制劑的使用對(duì)機(jī)體的免疫功能提高有一定的作用。其作用的機(jī)理可能是：①?gòu)?fù)合益生菌在動(dòng)物體內(nèi)活動(dòng)的過(guò)程中代謝產(chǎn)生大量的生理活性物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等，從而提高了體液免疫和細(xì)胞免疫的水平[17]；②復(fù)合益生菌制劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥降低腸道中致病性微生物的數(shù)量，使得腸道菌群平衡得到修復(fù)和調(diào)整，促進(jìn)了黏膜免疫，提高機(jī)體的免疫功能[18]；③益生菌進(jìn)入豬的腸道系統(tǒng)激活了體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生了類(lèi)似抗原的物質(zhì)，引起機(jī)體對(duì)一些病原微生物發(fā)生了免疫應(yīng)答反應(yīng)，因而使機(jī)體對(duì)病原微生物產(chǎn)生免疫作用[19]。

總之，益生菌對(duì)斷奶仔豬的作用效果，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)其腸道內(nèi)的微生物環(huán)境平衡來(lái)完成的，健康動(dòng)物的腸道是有益微生物在占主導(dǎo)地位，它們抑制腸道內(nèi)的有害菌生長(zhǎng)、抵抗病原微生物的侵入、代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸增強(qiáng)了胃腸壁的蠕動(dòng)、pH 下降又阻止了腸內(nèi)腐敗物的生成、凈化了腸道內(nèi)環(huán)境，對(duì)動(dòng)物的消化、吸收、免疫和健康起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，給斷奶的仔豬飼喂制備的復(fù)合益生菌產(chǎn)品，仔豬腸道中的乳酸桿菌數(shù)量顯著升高，而大腸桿菌的數(shù)量明顯下降，以0.2%添加組的效果最顯著，乳酸桿菌提高了9.68%，大腸桿菌顯著下降10.78%，這一結(jié)果與張建梅等的研究基本相同[20]。究其原因可能是：①?gòu)?fù)合菌中的植物乳桿菌在仔豬腸道內(nèi)代謝的過(guò)程中產(chǎn)生了乳酸，降低了腸道pH，抑制了有害菌在腸道內(nèi)的生長(zhǎng)與繁殖，提高了腸道內(nèi)乳酸桿菌的濃度[21]；②復(fù)合菌中的芽孢桿菌在腸道內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性的消化了大量氧氣，為乳酸菌、雙歧桿菌等的繁殖創(chuàng)造了有利條件，這使腸道內(nèi)的pH 降低，大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的繁殖受到了抑制，因此大腸桿菌的濃度呈下降趨勢(shì)[22]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑能夠提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、降低腹瀉率、提高機(jī)體免疫和改善腸道健康，且0.20%的添加效果較好，說(shuō)明益生菌制劑成為抗生素的替代品具有一定的可行性。