N-乙酰半胱氨酸對櫻桃谷鴨腸道能量代謝和抗氧化功能的影響

楊書慧，畢云天，程 強，譚靈琳，易 丹，侯永清，郭雙雙*，丁斌鷹*

（1.武漢輕工大學(xué)農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質(zhì)飼料資源教育部工程研究中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

N-乙酰半胱氨酸（NAC）是L-半胱氨酸的前體物質(zhì)，在小腸內(nèi)能夠快速代謝產(chǎn)生谷胱甘肽[1]，并能作為一種巰基來源和抗氧化劑參與機體內(nèi)與活性氧（ROS）的相互作用，從而減少機體的氧化應(yīng)激[2]。NAC 也能夠影響機體內(nèi)基因的表達和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，有保護DNA免受損傷[3]和減輕細(xì)胞凋亡的作用[4]。有研究報道，NAC 能夠緩解黃曲霉毒素B1對肉雞生長性能、腎臟損傷和生化指標(biāo)的不良影響[5]。

單磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）作為能量感受器參與調(diào)節(jié)機體的新陳代謝，AMPK-α1可以催化AMPK 磷酸化，從而調(diào)控機體能量代謝和脂質(zhì)代謝。周華金等[6]研究報道，肉雞產(chǎn)生熱應(yīng)激時，肝臟AMPK-α1的mRNA 水平與肝臟脂肪代謝的變化趨勢一致。低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1α）是調(diào)控細(xì)胞糖代謝的關(guān)鍵因子。Liu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α具有調(diào)控機體氧化應(yīng)激和糖代謝的雙重機制。黃嘌呤氧化還原酶（XOR）能夠催化多種底物發(fā)生氧化反應(yīng)。Franke 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，XOR 也能參與脂質(zhì)的代謝過程。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加500 mg/kg NAC 可以改善仔豬小腸的吸收功能[9]并能緩解由脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的仔豬腸道黏膜損傷，減輕LPS 對仔豬腸道造成的氧化應(yīng)激[10]；在肉鴨日糧中添加1 000 mg/kg NAC 顯著提高了飼料轉(zhuǎn)化率，添加500、1 000 mg/kg NAC 均能夠提高肉鴨肝臟的能量代謝水平和抗氧化功能[11]。目前，NAC 被廣泛應(yīng)用于臨床和畜牧業(yè)，但在肉鴨上的研究較少。本試驗旨在探究NAC 對肉鴨腸道能量代謝和抗氧化水平的影響，為NAC 在肉鴨日糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與基礎(chǔ)日糧 試驗選用90 只健康狀況良好的1 日齡櫻桃谷鴨，按體重相近、公母對半原則隨機分為3 個處理組，每個處理組設(shè)置3 個重復(fù)，每重復(fù)10 只。對照組肉鴨飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組分別在基礎(chǔ)日糧中添加500、1 000 mg/kg NAC。NAC 為市售級醫(yī)藥產(chǎn)品（純度≥99%）。添加500 mg/kg NAC 和1 000 mg/kg NAC分別增加了日糧中0.0042% 和0.0084% 的氮量，因此不必要在基礎(chǔ)日糧中添加非必需氨基酸來平衡3 個處理組日糧中的氮量。試驗期21 d?；A(chǔ)日糧參照NRC（1994）肉鴨（1～21 d）的營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制，基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理 試驗前將鴨舍、鴨籠、料槽、飲水器等打掃干凈并使用燒堿水消毒，對鴨舍整體進行熏蒸消毒。于試驗第7 天接種傳染性漿膜炎疫苗（疫苗購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院）。肉鴨采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式，自由采食與飲水，24 h 光照，肉鴨1～7 日齡時室溫控制在32～35℃，8～14 日齡時室溫控制在 24～28℃，15～21 日齡時室溫控制在24℃，鴨舍濕度控制在65%～70%。

1.3 樣品采集與處理 于試驗第22 天每重復(fù)隨機抽取2 只體重相近的肉鴨，頸部脫臼致死后屠宰取樣，取空腸和回腸于預(yù)冷的玻璃板上，剖開腸段后用預(yù)冷的無RNA 酶水沖洗腸道內(nèi)容物，用滅菌的載玻片于無菌操作臺上刮取腸黏膜，置于無RNA 酶的離心管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 空腸和回腸黏膜能量代謝指標(biāo) 用高效液相色譜法（HPLC）測定空腸和回腸黏膜中的三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的含量。將腸黏膜樣品于液氮中研磨成粉末，稱取0.1～0.2 g 的腸黏膜粉末置于5 mL 無菌離心管中，然后向離心管內(nèi)加入2 mL 預(yù)冷的高氯酸（c=1.5 mol/L），于冰上機械勻漿后，4℃下3 000 ×g 離心10 min，取1 mL 上清液于新的無菌離心管中，加入0.4 mL碳酸鉀溶液（c=2 mol/L），渦旋混勻，4℃下3 000 ×g 離心10 min，收集上清液于1.5 mL的無菌離心管中，用孔徑為0.22 μm 的濾膜過濾后上機待測。

色譜條件：高效液相色譜系統(tǒng)為Waters Breezes，由Waters 1 525 高效液相色譜泵、Waters 2 487 紫外吸收檢測器和Waters 717 自動進樣器組成。色譜柱采用Waters XBridge C18 柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）。流動相由K2HPO4-KH2PO4磷酸緩沖溶液∶色譜級甲醇（V:V）=77:23 配成，用磷酸調(diào) pH 至 7.0，使用前用 0.22 μm 的濾膜過濾。流動相流速設(shè)置為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為20℃；紫外檢測器檢測波長為260 nm。

根據(jù)保留時間確定對應(yīng)物質(zhì)，采用洗脫峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度計算空腸和回腸黏膜ATP、ADP 和AMP 的含量，結(jié)果以μg/g 樣品重表示，并計算腺苷池（TAN）和腺苷酸能荷（AEC）的水平。計算公式：

TAN=ATP+ADP+AMP

AEC=（ATP+0.5ADP）/（ATP+ADP+AMP）

1.4.2 空腸和回腸黏膜抗氧化指標(biāo) 采用南京建成生物技術(shù)有限公司試劑盒檢測腸黏膜樣品中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，以及丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）的含量。檢測方法參照試劑盒說明書。

1.4.3 空腸和回腸黏膜AMPK-α1、HIF-1α和XORmRNA水平 采用實時定量PCR 方法檢測空腸和回腸黏膜AMPK-α1、HIF-1α和XOR的 mRNA 水平。將腸段樣品從-80℃冰箱中取出后，迅速放入液氮中研磨。稱取0.1 g 左右的粉末樣品，加入裝有1 mL RNA 裂解液的無RNA 酶離心管中，充分裂解后，使用TRIzol（TaKaRa，大連）抽提法提取肉鴨空腸和回腸黏膜中的總RNA。采用Nanodrop 2 000 超微量分光光度計檢測RNA 濃度，然后用無RNA 酶水將所有RNA 樣品稀釋至同一濃度，然后使用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，最后將合成的cDNA 用于實時熒光定量PCR 的檢測。以GADPH和HPRT為內(nèi)參基因，檢測AMPK-α1、HIF-1α和XOR的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，相關(guān)檢測基因的引物序列見表2。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間差異顯著時采用鄧肯氏多重比較進行進一步分析。以P＜0.05 為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC 對櫻桃谷鴨空腸和回腸黏膜能量代謝水平的影響 由表3 可知，與對照組和500 mg/kg NAC 組相比，1 000 mg/kg NAC 組肉鴨空腸黏膜的ATP 含量顯著增加。與對照組和1 000 mg/kg NAC 組相比，500 mg/kg組空腸ADP 含量顯著降低。與對照組相比，500、1 000 mg/kg NAC 組的空腸AMP 含量、AMP/ATP 和TAN含量均顯著降低，但AEC 水平顯著提高。與500 mg/kg NAC 組相比，1 000 mg/kg NAC 組的空腸 AMP/ATP 顯著降低，但TAN 含量和AEC 水平顯著升高。結(jié)果表明，2 個劑量的NAC 均增加了空腸黏膜的能量儲備，且高劑量的NAC 作用效果更好。

與對照組和1 000 mg/kg NAC 組相比，添加500 mg/kg NAC 顯著提高了回腸黏膜的ATP 含量，顯著降低了AMP/ATP。與對照組相比，500、1 000 mg/kg NAC 組回腸ADP、AMP 和TAN 含量顯著降低。與500 mg/kg NAC 組相比，1 000 mg/kg NAC 組回腸ADP 含量顯著降低，AMP 和TAN 含量顯著提高。與對照組相比，500 mg/kg NAC 組回腸AEC 水平顯著增加，但1 000 mg/kg NAC 組AEC 水平顯著降低。結(jié)果表明，500 mg/kg NAC增加了回腸黏膜的能量儲備。

2.2 NAC 對櫻桃谷鴨空腸和回腸抗氧化酶活性及氧化還原狀態(tài)的影響 由表4 可知，與對照組和500 mg/kg NAC 組相比，添加1 000 mg/kg NAC 顯著提高了空腸黏膜中CAT 活性。與對照組相比，500、1 000 mg/kg NAC 組的空腸MDA 和H2O2含量均顯著降低。結(jié)果表明，2 個劑量的NAC 均提高了空腸黏膜的抗氧化功能，高劑量的NAC 作用效果更好。

與對照組相比，500 mg/kg NAC 組回腸MDA 含量顯著增加，1 000 mg/kg NAC 組回腸CAT 活性顯著增加，但回腸MDA 含量顯著降低。結(jié)果表明，低劑量的NAC 對回腸黏膜的抗氧化力有不利影響，但高劑量的NAC 對回腸黏膜具有抗氧化功能。

2.3 NAC 對櫻桃谷鴨空腸和回腸黏膜AMPK-α1、HIF-1α和XORmRNA 水平的影響 由圖1 可知，與對照組和 1 000 mg/kg NAC 組，500 mg/kg NAC 組空腸黏膜的AMPK-α1mRNA 水平顯著下調(diào)。與對照組相比，500、1 000 mg/kg NAC 組 空 腸HIF-1α和XOR的mRNA 水平顯著降低。結(jié)果表明，低劑量的NAC 對空腸能量和抗氧化相關(guān)基因的表達具有下調(diào)作用，而高劑量的NAC 僅對后者具有下調(diào)作用。

表3 NAC 對櫻桃谷鴨空腸和回腸黏膜能量代謝水平的影響

表4 NAC 對櫻桃谷鴨空腸和回腸抗氧化酶活性及氧化還原狀態(tài)的影響

圖1 NAC 對櫻桃谷鴨空腸和回腸黏膜AMPK-α1、HIF-1α 和XOR mRNA 水平的影響

與對照組相比，500、1 000 mg/kg NAC 組回腸HIF-1α的 mRNA 水平顯著下調(diào)，1 000 mg/kg NAC 組回腸的XORmRNA 水平顯著降低。結(jié)果表明，2 個劑量的NAC 對回腸抗氧化相關(guān)的基因均具有下調(diào)作用，高劑量的NAC 作用效果更好。

3 討 論

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加NAC 對櫻桃谷肉鴨的平均日增重和平均日采食量均無顯著影響，但添加1 000 mg/kg NAC 顯著提高了飼料轉(zhuǎn)化率[11]。

AMPK 是真核生物體內(nèi)的一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的細(xì)胞能量感受器。AMPK是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，當(dāng)細(xì)胞能量降低時AMPK 被激活[12]。一旦激活以后，AMPK 發(fā)生磷酸化，繼而使細(xì)胞中參與ATP 消耗的許多代謝酶失活，細(xì)胞中包括脂肪酸和蛋白質(zhì)合成在內(nèi)的ATP 消耗過程被抑制，同時ATP 生成的代謝通路被激活，包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸的吸收和氧化[13]。小腸的吸收功能包括許多需要能量供應(yīng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程，這些過程都依賴于能量代謝[14]。Yi 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，NAC 對LPS 刺激的仔豬空腸黏膜AMPK 的基因表達沒有顯著影響，但是NAC通過調(diào)控解偶聯(lián)蛋白2 和ADP/ATP 移位酶1 的基因表達改善了感染仔豬的腸道能量代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加500 mg/kg NAC 顯著降低了空腸黏膜AMPK-α1的mRNA 水平，這種差異可能是由于物種差異。

AMPK 可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)糖酵解和脂肪酸等分解途徑來維持ATP 的平衡，當(dāng)AMPK 活性升高時，體內(nèi)ATP 消耗通路就會被關(guān)閉，導(dǎo)致ATP 含量增加或AMP/ATP 降低[16]。本研究中，肉鴨日糧中添加500、1 000 mg/kg NAC 分別對肉鴨回腸和空腸的ATP 濃度和AEC 具有提高作用，對AMP/ATP 具有降低作用，對2 個腸段的AMP 濃度和TAN 都具有抑制作用。細(xì)胞內(nèi)的主要能量供應(yīng)物質(zhì)是ATP 和ADP，它們能夠通過ATP?ADP+Pi 相互轉(zhuǎn)化。ATP 水解過程所釋放的能量直接或間接地滿足大多數(shù)細(xì)胞生存的需要[17]。有學(xué)者認(rèn)為，TAN 和AEC 是比AMP 更敏感、更能反映組織能量狀態(tài)的指標(biāo)[18]。TAN 反映細(xì)胞內(nèi)總腺苷酸的儲備水平、線粒體的氧化呼吸活性以及合成高能磷酸化合物的能力[19]，而AEC 是用腺苷酸存在形式的比率來表示細(xì)胞能力狀態(tài)，它反映了ATP、ADP 和AMP 三者間的高能磷酸鍵的相互轉(zhuǎn)化情況[20]。當(dāng)AEC 數(shù)值增大表明機體內(nèi)可供細(xì)胞直接利用的高能化合物增多。本試驗結(jié)果表明，500 mg/kg NAC 提高了空腸和回腸黏膜的能量儲備，1 000 mg/kg NAC 只對空腸黏膜的能量代謝具有改善作用。NAC 在機體內(nèi)的主要吸收部位是小腸，NAC 進入機體后能夠代謝參與體內(nèi)的三羧酸循環(huán)和糖代謝[21]。Zhang 等[22]研究表明，NAC 能促進宮內(nèi)發(fā)育遲緩仔豬空腸的ATP 生成，改善空腸抗氧化功能，從而緩解腸道損傷。但是，NAC 對回腸能量代謝的調(diào)控作用鮮見報道。

Ju 等[23]研究還發(fā)現(xiàn)，激活的AMPK-α1 可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，ROS 能夠刺激機體細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并且根據(jù)氧化應(yīng)激的持續(xù)時間和程度來觸發(fā)多個信號通路。有研究報道，氧化應(yīng)激可以上調(diào)HIF-1α的mRNA水平[24]。低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是機體在缺氧條件下產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，它可以減少機體對氧的需求，提高組織細(xì)胞對低氧的適應(yīng)性，HIF-1α是HIF-1的一種亞基，與急性低氧應(yīng)激有關(guān)[25]。HIF-1α上調(diào)可以引起細(xì)胞炎癥，并激活細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達[26]。XOR 是一種與ROS 合成相關(guān)的酶，是嘌呤代謝的重要組成部分。XOR 含有分子氧的電子受體，當(dāng)XOR 與分子氧結(jié)合時能催化機體產(chǎn)生H2O2和超氧化物自由基。本試驗發(fā)現(xiàn)，在肉鴨日糧中添加500 mg/kg NAC 下調(diào)了空腸AMPK-α1的 mRNA 水平，2 個劑量的 NAC 降低了空腸和回腸HIF-1α和XOR的 mRNA 水平，這說明 NAC 具有減輕空腸和回腸氧化應(yīng)激的功能。尹鵬等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下NAC 能夠通過下調(diào)HIF-1α的表達來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。而目前，NAC 對XOR的表達和活性調(diào)節(jié)的報道還較少。NAC 可能通過下調(diào)AMPK-α1、HIF-1α和XOR的 mRNA 水平減少機體 ROS 的產(chǎn)生，減少機體的氧化應(yīng)激。

SOD、CAT 和GSH-Px 是機體內(nèi)常見的抗氧化酶，它們的活性強弱間接反映了機體抗氧化應(yīng)激的能力。MDA 是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。本試驗發(fā)現(xiàn)，在肉鴨日糧中添加2 個劑量的NAC 均有提高空腸黏膜中GSH-Px 活性的趨勢，顯著降低了空腸黏膜中MDA 和H2O2含量，添加1 000 mg/kg NAC 顯著提高了空腸CAT 活性。這說明NAC 提高了肉鴨空腸的抗氧化酶的活性，減少了機體代謝過程中氧自由基和過氧化反應(yīng)產(chǎn)物的生成，提高了空腸黏膜的抗氧化能力。本研究團隊前期的研究結(jié)果表明，500、1 000 mg/kg NAC 提高了肉鴨肝臟的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，降低了MDA 和H2O2水平，顯著改善了肝臟的抗氧化功能[11]。在仔豬上的研究表明，NAC 能夠降低豬流行性腹瀉病毒感染仔豬血漿和空腸H2O2含量，減少感染仔豬的氧化應(yīng)激[28]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，日糧中添加500、1 000 mg/kg NAC 均提高了肉鴨空腸黏膜的能量儲備和抗氧化功能，且高劑量的NAC 作用效果更好，兩者分別對回腸黏膜的能量代謝和抗氧化力具有改善作用。這些作用可能是通過下調(diào)AMPK-α1、HIF-1α和XOR的基因表達實現(xiàn)的。因此，推薦肉鴨日糧中添加1 000 mg/kg 的NAC。