支鏈氨基酸對斷奶仔豬腸道和肌肉氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響

張宇峰，田 敏，恒景會，陳 芳，鄧躍林，管武太，張世海

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510642）

支鏈氨基酸（BCAA）包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，是仔豬骨骼肌蛋白質(zhì)合成的重要底物，也參與動物體內(nèi)的代謝調(diào)控。日糧添加BCAA 可以提高仔豬體內(nèi)必需氨基酸和非必需氨基酸的含量，提高BCAA 代謝產(chǎn)物丙氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的肌肉凈利用率，還會提高仔豬各組織中組氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、脯氨酸和絲氨酸的凈利用率，從而促進(jìn)仔豬骨骼肌發(fā)育[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BCAA 可通過激活mTORC1 信號通路，從而進(jìn)一步激活下游信號分子S6K1 和4EBP1，調(diào)控機(jī)體蛋白的翻譯合成[2]。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體是一類廣泛存在于機(jī)體生物膜系統(tǒng)中的功能性蛋白，主要參與機(jī)體氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對蛋白質(zhì)的合成以及生理功能的維持有著重要作用[3]。氨基酸從腸道吸收進(jìn)入血液，隨后沉積進(jìn)入肌肉，都需要依賴氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。根據(jù)載體轉(zhuǎn)運(yùn)底物的特性，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在體內(nèi)可以分為酸性、堿性和中性三大類。機(jī)體中有部分載體主要負(fù)責(zé)BCAA 的轉(zhuǎn)運(yùn)，如L 型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要負(fù)責(zé)大多數(shù)細(xì)胞BCAA 的信號感知和傳輸，并啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)[4]。另一類BCAA 相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體是鈉偶聯(lián)中性AA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SNAT2/SLC38A2）[5]。同時，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)也具有一定組織偏好性。轉(zhuǎn)運(yùn)載體 ASCT2、B0AT1、CAT-1、y+LAT1、4F2hc、Pept-1 和rBAT 在腸道中的mRNA 表達(dá)量較高[6]，而轉(zhuǎn)運(yùn)載體PAT1、PAT2、LAT1、ASCT2、SNAT2、EAAT1和EAAC1 在肌肉中的mRNA 表達(dá)量較高[7]。

目前，有關(guān)日糧中不同劑量BCAA 對生長豬氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體影響的研究還相對很少。因此，本試驗(yàn)旨在探索飼糧中不同劑量BCAA 對仔豬腸道和肌肉中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響，為BCAA 在仔豬日糧中的合理利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物設(shè)計(jì) 選擇 18 頭（10.0±0.9）kg 杜 × 長 ×大三元雜交斷奶仔豬，公母比例相同，按體重和性別隨機(jī)分為3 個處理組，每個處理6 頭豬。分別給不同處理組中的仔豬飼喂低BCAA 缺乏日糧（L-BCAA）、BCAA正常日糧（N-BCAA）和BCAA 過量日糧（E-BCAA），基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。在試驗(yàn)第21 天開始屠宰，取仔豬空腸、腰肌、咬肌和腿肌樣品于-80℃液氮中保存待測。

1.2 主要儀器 PCR Express Gradient PCR 儀（HYBAID公司）、Gene Amp 7500 型實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、凝膠成像系統(tǒng)（法國VL 產(chǎn)品）、Eppendorf5810R 臺式高速室溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、DYY-III 型電泳儀、電泳槽（北京六一儀器廠）、微波爐（日本松下電器）、4℃冰箱（Haier）、- 20℃冰箱（Sanyo）、-80℃冰箱（Sanyo）。

1.3 主要試劑 Trizol 裂解液、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、DEPC處理的離心管及槍頭、定量PCR 試劑盒、PCRMIX、Taq 酶、DL2000 Ladder Marker（分子量為 2 000、1 000、750、500、250、100）均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（TaKaRa）。

1.4 mRNA 表達(dá)分析

1.4.1 RNA 的提取及實(shí)時熒光定量PCR 總RNA 提取、總RNA 中痕量DNA 的消化、樣品RNA 的反轉(zhuǎn)錄、Real-timePCR 參照李虹儀等[8]的方法。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考NCBI 中GenBank 公布的相關(guān)基因序列，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)各基因的上下游引物，送至上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2 和3。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行 Duncan′s多重比較和方差分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05 表示差異顯著，0.05＜P＜0.1 表示有趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 BCAA 對仔豬空腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響 如圖 1 所示，與 N-BCAA 組相比，L-BCAA 組中腸道中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ASCT2、SNAT2、B0AT1 和rBAT）、 堿 性 氨 基 酸 轉(zhuǎn) 運(yùn) 載 體（y+LAT、CAT1 和4F2hc）和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體（Pept1）的mRNA 表達(dá)量顯著增加，而E-BCAA 組中各氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)無顯著差異。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分

2.2 BCAA 對仔豬腰肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響 如圖2 所示，與N-BCAA 組相比，L-BCAA 組中腰肌中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PAT1、PAT2、SNAT2、LAT1）、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（CAT1）的mRNA 表達(dá)顯著增加；而

E-BCAA 組中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ASCT2 和SNAT4）、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（y+LAT1 和rBAT）、酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（EAAC1）的mRNA 表達(dá)顯著降低。各組間4F2hc 和EAAT1 的mRNA 相對表達(dá)量差異均不顯著。

表2 腸道相關(guān)目的基因及內(nèi)參基因β-actin 引物參數(shù)

表3 肌肉相關(guān)目的基因及內(nèi)參基因GAPDH 引物參數(shù)

圖1 BCAA 對仔豬空腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響

圖2 BCAA 對仔豬腰肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響

2.3 BCAA 對仔豬咬肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響 如圖3 所示，與N-BCAA 組相比，L-BCAA 組中咬肌中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ASCT2、PAT1 和PAT2）的mRNA表達(dá)顯著降低，4F2hc 和EAAT1 轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA 表達(dá)顯著增加；而E-BCAA 組中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ASCT2、PAT1、PAT2）和酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（EAAC1）的mRNA 表達(dá)顯著降低。各組間SNAT2、SNAT4、LAT1、y+LAT1、rBAT、CAT1 的 mRNA 相對表達(dá)量差異均不顯著。

圖3 BCAA 對仔豬咬肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響

2.4 BCAA 對仔豬腿肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響 如圖4 所示，與N-BCAA 組相比， L-BCAA 組中腿肌中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PAT1 和PAT2）、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（4F2hc）轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA 表達(dá)顯著降低；而E-BCAA 組中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PAT1 和PAT2）、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（4F2hc 和rBAT）、酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（EAAT1 和EAAC1）的mRNA 表達(dá)顯著降低。各組間 ASCT2、SNAT2、SNAT4、LAT1、y+LAT1 和 CAT1的mRNA 相對表達(dá)量差異均不顯著。

圖4 BCAA 對仔豬腿肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 BCAA 對仔豬空腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響 腸道是氨基酸吸收進(jìn)入動物體內(nèi)的第一道屏障。在腸道中存在許多氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，不同氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在機(jī)體中的生物學(xué)功能各不相同。如Na+依賴性中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT2 在谷氨酰胺和亮氨酸等中性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)交換中起著重要作用，是維持腸黏膜生長所必需[9]；rBAT 主要表達(dá)于腎臟和小腸，是陽離子氨基酸和胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)體[10]。CAT1 在小腸中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)精氨酸和賴氨酸等陽離子氨基酸[11]，而y+LAT1/4F2hc 轉(zhuǎn)運(yùn)體主要參與上皮細(xì)胞中陽離子氨基酸外流轉(zhuǎn)運(yùn)。PepT1 主要從膳食蛋白質(zhì)的消化過程中轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽[12]。上述氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腸道氨基酸的吸收中扮演著重要角色。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的膳食營養(yǎng)水平可以調(diào)控腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體在小腸的表達(dá)[13]。因此，本試驗(yàn)中假設(shè)日糧中不同氨基酸水平會調(diào)控腸道氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)水平。

采食量是影響氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的重要因素之一。Yang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，給雞限飼可以提高小腸PepT1 的mRNA 表達(dá)。Ihara 等[14]報(bào)道，給大鼠饑餓4 d、半饑餓（50% 對照組）10 d，或給予全腸外營養(yǎng)（TPN）10 d 時，PepT1 的 mRNA 水平分別增加179%、161%、164%。因此，與正常蛋白日糧相比，仔豬飼喂低蛋白日糧引起的采食量減少可能是導(dǎo)致本研究中PepT1 表達(dá)增加的原因之一。

此外，日糧中的氨基酸水平也是影響腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的重要因素之一。BCAA 是組織蛋白合成的底物。越來越多的研究表明，BCAA 作為營養(yǎng)信號和能量來源在調(diào)節(jié)代謝和維持生理功能中起著至關(guān)重要的作用[15]。一些轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)在氨基酸缺乏時會有所增加。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，給仔豬飼喂氨基酸缺乏日糧會降低其采食量，可導(dǎo)致LAT1 和SNAT2 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平增加，從而有效地增強(qiáng)BCAA 的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，Palii 等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，在日糧氨基酸缺乏時，也會上調(diào)一些腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)量。而日糧補(bǔ)充氨基酸后，由氨基酸缺乏導(dǎo)致的腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的上調(diào)，可以得到緩解。邱凱等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在低蛋白日糧中補(bǔ)充BCAA，空腸中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT2、CAT1、y+LAT、4F2hc 的mRNA 表達(dá)量顯著下降或有降低的趨勢。Zhang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在低蛋日糧中補(bǔ)充充足的BCAA 后，與低蛋白組相比，BCAA 組內(nèi)中性和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA 的表達(dá)水平較低。在本研究中同樣觀察到，飼喂L-BCAA 日糧可以增加仔豬空腸中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ASCT2、SNAT2、B0AT1）及堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（4F2hc、y+LAT、rBAT、CAT1）氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA 相對表達(dá)量。這表明飼喂氨基酸缺乏日糧的動物對氨基酸的生物利用率高于采食正常氨基酸日糧的動物[19]。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的增加是補(bǔ)償?shù)偷鞍兹占Z中氨基酸底物濃度不足的一種機(jī)制[16]。另一種機(jī)制可能是當(dāng)BCAA 缺乏時，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的增加將更多的氨基酸從細(xì)胞中運(yùn)出[20]。Li 等[16]研究表明，低蛋白（17%CP）日糧添加BCAA 后生長豬的生長性能可達(dá)到正常蛋白（20%CP）日糧水平，即各氨基酸底物能滿足仔豬的正常生長需求。本研究中，低蛋白（17.45%CP）日糧添加BCAA 后，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的增強(qiáng)得到緩解，與Li 等[16]研究一致。這一結(jié)果提示，適量BCAA 能補(bǔ)償?shù)偷鞍兹占Z中氨基酸底物供應(yīng)不足的問題。蛋白質(zhì)的合成是一個消耗能量的過程，作為一種重要的細(xì)胞能量傳感器，AMPKα被ATP激活后，可以傳遞維持能量穩(wěn)態(tài)的信號[21]。隨著轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)水平提高，P-AMPKα磷酸化隨之增強(qiáng)，但添加BCAA 會抑制P-AMPKα活性，即補(bǔ)充亮氨酸可抑制AMPKα磷酸化[22]，使得氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)降低。綜上所述，BCAA 可能通過調(diào)節(jié)小腸中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)來維持正常的腸道發(fā)育和氨基酸的生理吸收。

3.2 BCAA 對仔豬肌肉氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響 骨骼肌發(fā)育與氨基酸的肌肉凈利用率相關(guān)[1]。Suryawan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BCAA 和其他氨基酸相比具有更多的生理調(diào)控功能，包括促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、抑制蛋白質(zhì)的降解、調(diào)節(jié)采食量以及提高機(jī)體免疫等。張世海[24]研究表明，在日糧中添加異亮氨酸（LP+Ile，17.5%CP）能增強(qiáng)斷奶仔豬肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT1 和GLUT4的表達(dá)。BCAA 可能通過影響不同部位氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體代謝的動態(tài)平衡。因此，推測日糧中不同氨基酸水平能調(diào)控?cái)嗄套胸i肌肉中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。

日糧中的氨基酸水平是影響骨骼肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體重要因素之一。Duan 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，減少膳食粗蛋白質(zhì)含量會增加豬骨骼肌中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SNAT2 和LAT1的表達(dá)。Zhang 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中纈氨酸濃度的降低，血漿中蛋氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺濃度會增加。在骨骼肌中，轉(zhuǎn)運(yùn)載體（SNAT2 和SNAT4）介導(dǎo)著大多數(shù)谷氨酰胺的雙向跨膜運(yùn)動[27]。研究表明，血漿中的天冬氨酰等中性氨基酸是通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體LAT1 被肌細(xì)胞吸收，對血管平滑肌的生長至關(guān)重要[28]。EAAC1 和EAAT1 是谷氨酸的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)載體[29]。Wiltafsky 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂低蛋白日糧時，血漿中精氨酸、組氨酸和苯丙氨酸的濃度會增加，而CAT1 主要負(fù)責(zé)精氨酸等陽離子氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，也有研究報(bào)道，PAT1 和PAT2 不僅負(fù)責(zé)各種小型氨基酸的運(yùn)輸，它們也有能力作為超受體來影響肌肉蛋白質(zhì)代謝[31]。Yin 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，給仔豬飼喂亮氨酸缺乏日糧時血漿中的賴氨酸和色氨酸高于正常蛋白組，而4F2hc 主要負(fù)責(zé)上皮細(xì)胞中賴氨酸的外流轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究中，同樣觀察到飼喂L-BCAA 日糧會上調(diào)仔豬腰肌中（PAT1、PAT2、SNAT2、LAT1 和CAT1）、咬肌中（4F2hc和EAAT1）氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。這與先前的研究一致，即飼喂低蛋白日糧時，血液中氨基酸濃度的增加促進(jìn)了骨骼肌中一些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。

此外，Yoshizawa 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，對缺乏食物的大鼠口服亮氨酸可促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，抑制肌纖維蛋白的降解。Zheng 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加BCAA 可促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，抑制蛋白的降解。本研究也發(fā)現(xiàn)，飼喂L-BCAA 日糧時，仔豬咬肌中（ASCT2、PAT1 和PAT2）、腿肌中（PAT1、PAT2 和4F2hc）氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA 相對表達(dá)量會降低，而在補(bǔ)充BCAA 后氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)明顯提高。說明適量的BCAA 可以促進(jìn)骨骼肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT2 主要負(fù)責(zé)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等中性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)交換，BCAA 缺乏會影響咬肌中ASCT2 的表達(dá)。有趣的是BCAA 缺乏使咬肌中（PAT1 和PAT2）和腿肌中（PAT1 和PAT2）氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)量降低，而腰肌中（PAT1 和PAT2）的表達(dá)反而會增加。這說明同種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在不同組織中的表達(dá)會不同，具有一定的組織偏好性[25]。

Wessels 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度亮氨酸會促使纈氨酸和異亮氨酸分解加強(qiáng)，給仔豬飼喂過量亮氨酸日糧時，幾乎所有組織中的游離纈氨酸和異亮氨基酸的濃度會降低。血漿中半胱氨酸濃度隨日糧中異亮氨酸和纈氨酸濃度的增加而降低[27]。因此，推測高濃度BCAA 對血液中其他氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)會有抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)飼喂E-BCAA 日糧時，會降低腰肌中（ASCT2、SNAT4、y+LAT1、rBAT、EAAC1）、咬肌中（ASCT2、PAT1、PAT2、EAAC1）、腿肌中（PAT1、PAT2、4F2hc、rBAT、EAAT1、EAAC1）氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。這與Suryawan 等[23]的研究一致，即BCAA 過多會抑制AMPKα磷酸化，從而抑制骨骼肌中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。綜上所述，BCAA 可能通過調(diào)節(jié)肌肉中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)來維持正常的肌肉發(fā)育。

4 結(jié) 論

日糧中BCAA 水平在調(diào)控仔豬腸道和骨骼肌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA 的表達(dá)中扮演重要角色。BCAA 不足會增加腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ASCT2、SNAT2、B0AT1、Pept1 及 4F2hc、y+LAT、rBAT 和 CAT1） 的 表 達(dá)；而BCAA 過多時會抑制腰肌（ASCT2、SNAT4、y+LAT1、rBAT、EAAC1）、咬?。ˋSCT2、PAT1、PAT2、EAAC1）和腿?。≒AT1、PAT2、4F2hc、rBAT、EAAT1、EAAC1）中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。