定時輸精前激素處理對后備母豬妊娠早期子宮發(fā)育的影響

劉 闖，魏巧莉，潘建治，朱志偉，陳曉宇，華衛(wèi)東，李俊杰,3*

（1.河北農業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071000；2.浙江省農業(yè)科學院，浙江杭州 310021；3.河北省牛羊胚胎工程技術研究中心，河北保定 071000）

母豬定時輸精技術是以卵泡發(fā)育同步化和排卵同步化為基礎，利用外源生殖激素對母豬的發(fā)情、排卵時間進行調控，從而使輸精時間更加精確，實現(xiàn)整個豬群在預定時間完成輸精配種[1-2]。定時輸精在提高母豬發(fā)情率、排卵率、后備母豬利用率、促進豬場批次化生產等方面具有顯著效果[3-5]，然而，在母豬產仔數這一重要生產指標上，定時輸精仍存在一定爭議。有研究表明定時輸精程序可以提高后備母豬的產仔數和活仔數[6-7]，但也有研究表明定時輸精程序對后備母豬產仔數無顯著影響甚至可能會降低[8-9]。母豬在早期妊娠過程中，有20%～25%的胚胎不能正常附植而死亡，這一過程直接影響母豬的最終產仔數[10]，因此胚胎能否成功附植是決定胚胎是否存活的關鍵因素[11]。子宮內膜對于胚胎附植的建立和維持非常重要，除了胚胎自身要有附植能力外，子宮內膜同時會發(fā)生一系列變化，附植位點及其周圍的組織重塑，使胚胎附植能夠順利完成[12]。生殖系統(tǒng)的發(fā)育往往需要生殖激素的參與，因此推斷定時輸精處理會影響母豬生殖系統(tǒng)的發(fā)育。本實驗通過觀察定時輸精處理后妊娠早期母豬子宮形態(tài)的變化，從組織水平探究定時輸精影響后備母豬產仔性能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取240 日齡左右體況健康的后備母豬若干頭（大于試驗所需母豬頭數，防止采樣時因存在未妊娠母豬導致樣品采集不全），品種為約克夏豬（大白），分為對照組（C 組）和定時輸精組（FTAI 組），對照組后備母豬自然發(fā)情、查情后進行人工輸精，定時輸精組后備母豬按照定時輸精程序處理。最后一次輸精結束記為妊娠第0 天，在妊娠第16 天和第25 天對后備母豬子宮組織進行樣品采集，分別記為FTAI_16 組（3 頭）、C_16 組（3 頭）、FTAI_25 組（3 頭）、C_25 組（3 頭）。試驗期間，所有母豬飼養(yǎng)管理條件一致，日糧為常規(guī)日糧及妊娠料，自由飲水。不同分組母豬分舍飼養(yǎng)。

1.2 實驗試劑及儀器 本實驗后備母豬定時輸精程序所需藥品烯丙孕素、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-Releasing Hormone，GnRH）、孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）均由寧波三生生物科技有限公司提供；HE 染色所需蘇木精溶液、伊紅溶液，組織切片所需儀器如輪轉式切片機（徠卡RM2016）、石蠟包埋機（徠卡YB-6LF）、攤片機（徠卡HI1210）等均由河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院基礎試驗室提供；樣品采集所需固定液及后續(xù)試驗所需試劑二甲苯、梯度酒精及觀察切片所需光學顯微鏡（Nikon DSU3）由河北農業(yè)大學動物科技學院胚胎中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 輸精程序 后備母豬選擇并分組完成后，F(xiàn)TAI 組按后備母豬定時輸精程序處理，主要步驟[3]：連續(xù)飼喂烯丙孕素18 d，停止飼喂后間隔42 h 注射PMSG（孕馬血清促性腺激素）注射劑，PMSG 注射完成后間隔80 h 注射GnRH（促性腺激素釋放激素），GnRH 注射完成后第16 h 進行第1 次人工輸精，第40 h 進行第2次人工輸精。對照組不做任何處理，自然發(fā)情，人工查情配種。

1.3.2 樣品采集 在妊娠第16 天時，隨機挑選健康母豬進行屠宰，用80 mL 沖胚液沖洗子宮角，在沖出液中觀察到胚胎，則視為妊娠母豬并進行樣品采集，稱量子宮重量后，將子宮角沿子宮系膜縱向剪開，對后續(xù)需要HE 染色的樣品如子宮內膜修剪后放入4%多聚甲醛中固定保存。最終定時輸精組和對照組各采集3 頭、共計采集6 頭妊娠后備母豬的組織樣品。

妊娠第25 天采樣流程與第16 天類似，妊娠25 d時母豬已經完成附植，可直接觀察到是否妊娠，不再進行沖胚操作，最終同樣分別在各組采集3 頭、共計采集6 頭妊娠后備母豬的組織樣品。

1.3.3 HE 染色 主要步驟為固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、染色、封片、鏡檢觀察，詳細步驟參考HE 病理染色技術操作步驟[13]進行。

1. 4 統(tǒng)計分析 對試驗所得數據使用Excel 進行初步整理，再用SPSS 22.0 對數據進行雙因素方差分析，結果使用平均值± 標準差表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 定時輸精程序處理對后備母豬子宮重量與子宮角長度影響 如表1 所示，在妊娠第16 天時， FTAI 組和C 組的子宮重量不存在顯著差異，但在妊娠第25 天時，F(xiàn)TAI 組子宮重量顯著高于C 組。

妊娠第16 天時，無論是左側還是右側以及總子宮角長度，F(xiàn)TAI 組都顯著高于C 組；妊娠第25 天時，F(xiàn)TAI 組左側、右側以及總子宮角長度仍顯著高于C 組。

表1 定時輸精處理對早期妊娠后備母豬子宮發(fā)育的影響

2.2 子宮內膜HE 染色 子宮內膜HE 染色結果如圖1所示，定時輸精程序處理后，無論是妊娠第16 天還是妊娠第25 天， FTAI 組子宮內膜固有層內微血管比C組更致密豐富；與C 組相比，F(xiàn)TAI 組子宮內膜固有層內腺體豐度提高，同時腺體的發(fā)育也更發(fā)達，F(xiàn)TAI 組內膜腺體更多的呈線狀或長條狀，而C 組腺體則主要呈點狀；此外，F(xiàn)TAI 組固有層內腺體無論是在基底側還是子宮腔側都有分布，在整個固有層內均勻分布，而C 組固有層內腺體則主要聚集分布在基底側，在子宮腔側分布較少。

圖1 定時輸精處理后對后備母豬早期妊娠子宮內膜的影響（HE，40×）

3 討 論

子宮容量是影響早期胚胎存活率的一個重要因素[14]。在母豬妊娠25～30 d，胚胎附植已基本完成，如果胚胎數超出子宮容量，會造成子宮內空間不足，加劇各胚胎之間的競爭以獲得足夠的子宮面積來滿足發(fā)育所需要的物質交換，在此期間會造成10%～15%的胚胎死亡[15]。杜雪蓮等[16]在探究孕激素影響大鼠子宮發(fā)育的試驗中發(fā)現(xiàn)，被切除卵巢的大鼠在孕激素處理后，子宮體積明顯增大，重量顯著增加，表明孕激素處理后可以影響大鼠子宮發(fā)育。本研究中，定時輸精程序處理后，實驗組母豬的子宮角長度、子宮重量都顯著高于對照組，表明定時輸精處理后可以促進妊娠母豬子宮的發(fā)育，增加早期妊娠子宮容量，為早期胚胎附植和存活提供更有利的條件。

豬的胎盤屬于上皮絨毛膜胎盤，除兩級和子宮腺開口處外，幾乎全部貼附于子宮內膜上。子宮內膜對豬妊娠的建立和維持非常重要，在妊娠的整個階段，為了滿足胚胎發(fā)育，子宮內膜作為母體胎盤，在結構上也要不斷的生長和發(fā)生重塑，這種狀態(tài)稱為子宮內膜容受性，只有在這種狀態(tài)下，胚胎才能黏附并誘導子宮內膜發(fā)生重塑，成功完成附植[17-19]。本實驗結果顯示，定時輸精處理后，實驗組母豬子宮內膜固有層厚度增厚。于佳鑫等[20]使用雌激素處理小鼠1 周，發(fā)現(xiàn)小鼠子宮內膜外膜均增厚，表明外源生殖激素可影響子宮內膜發(fā)育，這與本實驗結果相似。本研究還觀察到處理組子宮內膜微血管更加致密豐富，由于母體和胎兒的物質交換都需要經過母體血管內皮，尤其是胎兒營養(yǎng)物質的來源主要來自母體血液的交換，因此更加致密豐富的血管更有利于胎兒的發(fā)育[21-22]。產仔數性能也與子宮內膜血管分布有關，梅山豬的子宮大小和形態(tài)與大白豬沒有顯著差異，但是其胎盤上的血管卻更加豐富，每單位胎盤表面積允許更多的營養(yǎng)物質交換，因此梅山豬在子宮比較擁擠時仍能維持較高的胚胎成活率[23]。

所有哺乳動物的子宮內膜都含有豐富的腺體，子宮內膜腺體能分泌多種物質，除對胎兒具有重要營養(yǎng)作用外，對于胚胎著床、妊娠識別和胎兒的存活與發(fā)育也起到重要的調節(jié)作用[24]。尤其對于豬這種上皮絨毛膜胎盤類型，子宮內膜腺體在整個妊娠期間一直發(fā)揮著重要作用，子宮內膜腺體可以將分泌物運送到絨毛間隙，對母胎界面生物學行為的調節(jié)起重要作用[25]。在妊娠期間，子宮內膜腺體的大小和寬度都會增加，從而增加其分泌活性來滿足胎兒生長發(fā)育的需要[26]。王志強等[27]在探究生殖激素對初情期牦牛子宮生長發(fā)育的影響試驗中發(fā)現(xiàn)，發(fā)情期牦牛子宮內膜中淺層腺體、深層腺體數量均多于乏情期牦牛，說明生殖激素能夠有效地作用于子宮腺體的生長發(fā)育。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，定時輸精處理后試驗組母豬子宮內膜固有層內腺體在形態(tài)、分布上也與對照組存在顯著差異，主要表現(xiàn)為形態(tài)更發(fā)達、分布更均勻，子宮內膜腺體的這些變化在一定程度上也會對胚胎的附植和發(fā)育產生影響。

綜上，本實驗結果表明定時輸精程序處理可促進妊娠母豬子宮的發(fā)育，對子宮內膜固有層的厚度以及固有層微血管和腺體的發(fā)育也有一定影響，而這些變化與胚胎附植和早期妊娠過程關系密切，因此定時輸精程序處理很有可能通過改變早期妊娠母豬的子宮狀態(tài)影響后備母豬胚胎存活率，最終影響后備母豬產仔數。