催乳素及其受體在右玉邊雞卵巢中的表達(dá)及與就巢性的相關(guān)性研究

張俊珍，李彩娥，張 蒙，苗志強(qiáng)，李建慧，姬凱元,3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，山西太谷 030801；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230000）

邊雞主要分布在山西省右玉縣，是在當(dāng)?shù)靥囟ǖ纳鷳B(tài)環(huán)境條件下經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇和人工選擇而形成的一個(gè)獨(dú)特的地方品種，具有蛋重大、肉質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼和抗寒等特點(diǎn)，但其就巢性強(qiáng)[1]。家禽就巢與卵泡發(fā)育緊密相關(guān)，就巢開(kāi)始時(shí)，卵泡發(fā)育停止[2-3]。催乳素（Prolactin，PRL）是由單基因編碼的多肽類激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與生長(zhǎng)激素（Growth Hormone，GH）十分相似，屬于生長(zhǎng)激素家族[4-5]，可抑制垂體促性腺激素的分泌，使禽類的卵泡發(fā)育受到抑制。催乳素受體（Prolactin Receptor，PRLR）作為催乳素靶向調(diào)控蛋白，參與了家禽的就巢過(guò)程[6]。PRL 和PRLR 相互結(jié)合在禽類產(chǎn)蛋和就巢行為中發(fā)揮作用。

在家禽產(chǎn)蛋和就巢生物學(xué)過(guò)程中，卵泡發(fā)育是一個(gè)以形態(tài)變化為特征的生長(zhǎng)過(guò)程，在此過(guò)程中，顆粒細(xì)胞因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在卵泡發(fā)育中的重要作用而被看作卵泡發(fā)育的一個(gè)重要標(biāo)志[7]。卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞間形成間隙連接，這種縫隙連接對(duì)于二者的交叉對(duì)話起重要作用，即顆粒細(xì)胞可以調(diào)節(jié)和影響卵母細(xì)胞并促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)，卵母細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)防止顆粒細(xì)胞過(guò)早分化，以維持顆粒細(xì)胞的發(fā)育[7-8]。在縫隙連接通訊中，有許多物質(zhì)從顆粒細(xì)胞運(yùn)輸?shù)铰涯讣?xì)胞，從而對(duì)卵母細(xì)胞起調(diào)控等作用，以階段性地控制從原始卵泡到生長(zhǎng)卵泡的發(fā)育[9]。高濃度的PRL（1 mg/mL）抑制卵泡顆粒細(xì)胞合成孕酮[10]；禽類就巢的起始伴隨著PRL 升高，就巢的結(jié)束伴隨著PRL 降低[11-12]；也有人認(rèn)為中等含量的PRL 可以維持較高的產(chǎn)蛋水平[13]。PRL 需要通過(guò)與靶細(xì)胞膜表面的PRLR 進(jìn)行結(jié)合，才能啟動(dòng)相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程最終實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)過(guò)程[14]。關(guān)于右玉邊雞PRL 和PRLR 的表達(dá)情況與卵泡發(fā)育間的關(guān)系未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。本研究將對(duì)PRL 和PRLR 在右玉邊雞不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)進(jìn)行較系統(tǒng)的研究，為家禽優(yōu)勢(shì)卵泡選擇及提高繁殖性能提供理論依據(jù)，為地方優(yōu)質(zhì)雞種的開(kāi)發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 購(gòu)買右玉邊雞蛋350 枚，進(jìn)行人工孵化，出殼245 只進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)雞均在相同條件下飼養(yǎng)至330 日齡過(guò)程中，分別采集70、165、220、330 日齡各5 只雞的卵巢組織作為蛋白質(zhì)提取和免疫組織化學(xué)材料，取220 日齡和330 日齡各15 只雞的血液作為ELISA 的材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞卵巢總蛋白的提取 取液氮冷凍的雞卵巢組織，用總蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）提取卵巢組織總蛋白。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 石蠟切片常規(guī)梯度酒精脫蠟后。用檸檬酸鹽緩沖液高溫抗原修復(fù)和3%H2O2 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物活性、正常牛血清封閉，37℃孵育30 min。之后，加兔源的PRL 和PRLR（多克隆一抗1:200 稀釋），4℃過(guò)夜，PSS 洗3 次。然后，滴加二抗（HRP 山羊抗兔IgG），37℃孵育1 h，PBS 洗3 次。DAB 顯色液、蘇木精染色后，經(jīng)梯度酒精脫水透明，用中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察。PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3 Western 印跡 用RIPA 提取右玉邊雞卵巢組織總蛋白，每孔上樣總蛋白為300 μg，SDS PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至NC 膜；經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h 后分別加入PRL 和PRLR 兔多克隆抗體（1 000 倍稀釋），4℃過(guò)夜孵育。次日，TBST 洗膜。加入二抗（HRP 山羊抗兔IgG），室溫孵育2 h，TBST 洗膜后加發(fā)光液，曝光，壓片，觀察結(jié)果。

雞卵巢組織總蛋白的PRL 和β-actin 免疫印跡結(jié)果用Image-pro plus 6.0 軟件（OLYMPUS 公司）對(duì)其進(jìn)行半定量分析，測(cè)定印跡條帶面積和灰度值，所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0 軟件應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同樣本的光密度用單因子方差分析，分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)不同日齡右玉邊雞血清中的PRL 含量采集220 日齡和330 日齡各15 只雞血液，通過(guò)間接ELISA 方法檢測(cè)雞血清PRL 含量。用96 孔酶標(biāo)板包被雞血清，置于4℃過(guò)夜。棄孔內(nèi)包被液體，加入100 μL封閉液（含3% BSA 的PBS 緩沖溶液）于37℃封閉1 h。棄孔內(nèi)封閉液，加入100 μL 用PBST 梯度稀釋（稀釋度從1:100 開(kāi)始，倍比稀釋11 個(gè)稀釋度）的PRL 一抗，37℃孵育1 h。用PBST 洗液（含5‰ Tween 的PBS 緩沖溶液）洗板5 次。在每孔中加入100 μL HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗（稀釋度為1:50 000），37℃孵育1 h。加入100 μL 顯色底物，避光反應(yīng)5 min，而后在每孔中加入50 μL 終止液終止反應(yīng)。將96 孔酶標(biāo)板置于讀板機(jī)上讀取OD450吸收值?？瞻讓?duì)照為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 PRL 在不同日齡雞卵巢中的分布和表達(dá) 經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)法染色的卵泡組織切片，PRL 免疫陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)可見(jiàn)于卵泡腔、基膜、顆粒層細(xì)胞、卵泡膜。PRL 在165 日齡的雞卵巢呈強(qiáng)陽(yáng)性，尤其是顆粒細(xì)胞中。如圖1 所示，PRL 在70、220、330 日齡表現(xiàn)為弱免疫陽(yáng)性，尤其是70 日齡。且220 日齡的免疫陽(yáng)性弱于330 日齡，70 日齡陽(yáng)性免疫反應(yīng)最弱。對(duì)照組未出現(xiàn)免疫陽(yáng)性反應(yīng)。

Western Blotting 結(jié)果顯示，雞卵巢總蛋白中存在能與兔抗PRL 多克隆抗體發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白條帶，且分子量大小符合實(shí)際大小。對(duì)不同日齡的雞卵巢內(nèi)PRL 蛋白表達(dá)進(jìn)行定性分析。從圖2-A 可以看出，在165 日齡的雞卵巢中PRL 蛋白水平表達(dá)較高，而在70 日齡的雞卵巢中檢測(cè)到的信號(hào)較弱。圖2-B 的半定量分析結(jié)果顯示，PRL 蛋白在70、165、220、330 日齡的雞卵巢中的平均蛋白含量差異顯著。

圖2 PRL 在不同日齡雞卵巢中的表達(dá)水平

2.2 PRLR 在不同日齡卵巢中的表達(dá)情況 如圖3 結(jié)果顯示，PRLR 的表達(dá)水平與邊雞日齡密切相關(guān)，在不同的發(fā)育階段均有表達(dá)。如圖4 顯示，蛋白表達(dá)量為165日齡 ＞330 日齡 ＞220 日齡 ＞70 日齡（P＜0.05）。

2.3 PRL 在右玉邊雞血清中的含量差異分析 如圖5 所示，330 日齡的雞血清中PRL 含量是220 日齡雞血清中 PRL 含量的 4 倍（P＜0.01）。

3 討 論

圖3 PRLR 在不同日齡雞卵巢中的分布

圖4 PRLR 在不同日齡雞卵巢中的表達(dá)水平

圖5 PRL 在右玉邊雞血清中的含量差異

禽類的就巢行為是遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌等共同作用的結(jié)果。家禽中，白來(lái)航雞幾乎無(wú)就巢性，其他品種均具有不同程度就巢性。禽類就巢機(jī)理一般是產(chǎn)蛋期間卵泡分泌大量雌二醇，雌二醇與孕酮相互作用下，下丘腦5-羥色胺（5-HT）和多巴胺（DA）活性增強(qiáng)，并釋放血管活性肽（Vasoactive Intestinal Poly-peptide，VIP），VIP 促進(jìn)垂體前葉分泌PRL，PRL 對(duì)啟動(dòng)和維持就巢是關(guān)鍵[15]。Proudman 等[16]利用放射性免疫法研究了火雞就巢期間和產(chǎn)蛋期間PRL 水平的變化，發(fā)現(xiàn)火雞繁殖期PRL 水平具有顯著差異，就巢期間的PRL 水平大約是產(chǎn)蛋期的9 倍。但另一些研究者得出了不同的結(jié)論。Reddy 等[17]同樣利用放射性免疫法研究了PRL 水平在白來(lái)航雞繁殖期的水平變化，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋期中PRL一直保持在很高水平，高于火雞就巢期間PRL 的水平。March 等[18]利用克隆雞PRL基因表達(dá)了PRL 融合蛋白，通過(guò)對(duì)腳雞主動(dòng)免疫融合蛋白，使雞體內(nèi)產(chǎn)生了PRL抗體，從根本上抑制了矮腳雞就巢的發(fā)生，在免疫后的一段時(shí)間里產(chǎn)蛋性能提高。陳峰等[19]利用VIP 氨基端15 氨基酸殘基片段與BSA 偶聯(lián)產(chǎn)物作為抗原對(duì)泰和雞進(jìn)行了主動(dòng)免疫，發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)免疫后有效抑制了就巢行為的增加，同時(shí)使產(chǎn)蛋率重新明顯上升，并再次形成一個(gè)產(chǎn)蛋高峰?；痣u和鴿子在就巢時(shí)，PRL 濃度明顯升高來(lái)維持正常孵化期[16]。本研究結(jié)果表明，PRL 與卵泡發(fā)育具有很大的相關(guān)性，但是從表達(dá)量來(lái)看，PRL 在右玉邊雞中起著促進(jìn)卵泡發(fā)育、促進(jìn)就巢兩方面的作用，尤其是進(jìn)入就巢時(shí)，PRL 水平與雞的產(chǎn)蛋量呈負(fù)相關(guān)。

大量研究表明，PRL 是維持家禽就巢行為的主要激素，PRLR 參與調(diào)控就巢行為的發(fā)生和維持。張旭等[20]研究表明，性成熟前籽鵝PRL 和PRLR 的表達(dá)量先降低后升高，PRL 對(duì)卵巢的反應(yīng)能力較弱，不會(huì)抑制卵巢發(fā)育；產(chǎn)蛋期后，尤其是產(chǎn)蛋中、后期，二者的表達(dá)量逐漸上升，PRL 與PRLR 特異性結(jié)合，引發(fā)就巢行為。陳興勇等[21]采用熒光定量PCR 法對(duì)皖西白鵝不同時(shí)期卵巢中的PRLR mRNA 的表達(dá)研究表明，PRLR 在卵巢組織中高表達(dá)量是維持就巢發(fā)生的主要因素。汪峰[22]對(duì)雪山草雞不同時(shí)期卵巢中的PRL 及PRLR 的研究表明，PRLR 的表達(dá)量與產(chǎn)蛋性能呈負(fù)相關(guān)。沈曼曼[23]對(duì)肉鴿不同時(shí)期卵巢中的PRLR 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，卵巢中PRLR 的表達(dá)量較高時(shí)會(huì)抑制卵巢卵泡的發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRLR 在右玉邊雞卵巢中隨著日齡增長(zhǎng)其表達(dá)量發(fā)生變化，表明右玉邊雞進(jìn)入產(chǎn)蛋期前，PRLR的表達(dá)量雖然逐漸升高，但并不會(huì)抑制卵泡發(fā)育；右玉邊雞產(chǎn)蛋后期PRLR 的表達(dá)量逐漸升高，卵泡發(fā)育受到抑制，誘發(fā)就巢行為的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，PRLR 與PRL 表達(dá)方式一致，二者發(fā)生特異性結(jié)合，抑制了卵巢卵泡的發(fā)育，從而進(jìn)入就巢期。ELISA 檢測(cè)產(chǎn)蛋高峰期和就巢期PRL 水平驗(yàn)證了PRL 與就巢的相關(guān)性。綜上可知，PRL 可作為右玉邊雞優(yōu)勢(shì)卵泡選擇及繁殖性能篩選的候選基因，為地方優(yōu)質(zhì)雞種的開(kāi)發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。