一貫煎對大鼠肝星狀細胞雌激素受體的影響

郭敏,劉真,張麗慧,劉雪濤,張立果,桑鋒*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000)

肝纖維化是一個病理學(xué)概念，是指肝組織內(nèi)肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)等活化，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分過度增生與異常沉積，肝臟結(jié)構(gòu)或(和)功能異常的病理變化，結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為肝竇毛細血管化、匯管區(qū)與肝小葉內(nèi)纖維化；功能上可以表現(xiàn)為肝功能減退、門靜脈高壓等，是所有肝臟疾病末期并發(fā)癥的基礎(chǔ)，最終結(jié)局是形成肝硬化，甚至肝癌。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在人群中除了原發(fā)性膽汁性肝硬化外，肝纖維化男女發(fā)病率之比為2.3∶1～2.6∶1[1-2],但絕經(jīng)后女性的發(fā)病率要高于相同年齡階段的男性。研究發(fā)現(xiàn),雌激素在肝硬化進展中可以起到保護作用[3],主要通過肝星狀細胞表面的雌激素受體及其介導(dǎo)的相關(guān)信號通路，抑制肝星狀細胞活化，從而發(fā)揮抗肝纖維作用，因此雌激素受體調(diào)節(jié)劑作為抗肝纖維化的新靶點具有廣泛的應(yīng)用前景?；谝回灱寰哂酗@著影響雌激素水平的作用，及其在抗肝纖維化治療的廣泛應(yīng)用，本課題擬從對HSC雌激素受體影響方面進一步探討一貫煎抗肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

SPF級健康雌性SD大鼠25只，體質(zhì)量(200±20)g，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(豫)2015-0004。大鼠肝星狀細胞株HSC-T6細胞由河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院惠贈。本動物實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準，符合實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 藥物與試劑

一貫煎組成：沙參10 g，麥冬10 g，當歸10 g，生地黃30 g，枸杞子15 g，川楝子5 g，由四川新綠色藥業(yè)提供。雌二醇由中國藥檢所提供，使用前溶于DMSO備用。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原ELISA試劑盒(博士德生物，EK0412)；ERα及ERβ引物(上海生工公司合成)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京Vazyme)；熒光定量PCR試劑盒( 南京Vazyme)；Trizol(Ambion，15596-026)。

1.3 儀器

顯微鏡LEICADM4000；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，ICV-450)；全自動酶標儀(Thermo scientific，MultiskanMK3)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-7C)；酶標儀(Thermo，mμlISKANMK3)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-24DN)；實時熒光定量PCR儀(ABI，QuantStudio 6)；微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司，Nano-100)；紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY02S)。

1.4 含藥血清制備

藥物血清制備參照徐叔云主編的《藥理實驗方法學(xué)》相關(guān)內(nèi)容。SPF級健康雌性SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，使用標準顆粒飼料，自由進食水。分為5組，每組5只，按體表面積算出每只大鼠所需藥物(大鼠等效劑量為人體的6.3倍)，一貫煎提取物經(jīng)純凈水溶解后按高、中、低3個劑量(4.1、8.4、16.8 g/kg)灌胃；空白組：給與同等量的純凈水灌胃；陽性組：雌二醇(0.1 mg/kg)灌胃。每天早上8點、晚上8點各給藥1次,共7天，在末次給藥后1 h腹主動脈取血,4 ℃靜置2 h，3 000 r/min,離心15 min,取血清,分離的血清同組混勻，經(jīng)恒溫水浴56 ℃ 30 min滅活補體，在超凈臺用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌分裝，放入-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HSC-T6細胞培養(yǎng)及分組

HSC-T6細胞用含有10%熱滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2、完全飽和濕度條件下CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，用胰蛋白酶消化傳代，將處于對數(shù)生長期的HSC-LX2細胞以一定密度(5×105/mL)在24孔板中接種。分別為空白組(加入空白組鼠血清)、雌二醇血清組、一貫煎高劑量血清組、一貫煎中劑量血清組和一貫煎低劑量血清組共5組，血清添加量為10%，每組設(shè)8個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，分別收集細胞和上清液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MTT法測細胞增殖

細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，消化、分離，以一定密度(5×105/mL)于24孔板中接種，每孔100 μL。加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔，震搖溶解10 min后，用酶標儀測定490 nm的光吸收度(OD)值。

1.7 ELISA法測Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達

培養(yǎng)48 h后以1 700 r/min離心5 min，收集上清液。參照試劑盒說明用酶標儀檢測450 nm處OD值。通過標準曲線計算各組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原濃度。

1.8 Real time-PCR法檢測ERα、ERβ mRNA表達

分組培養(yǎng)48 h后，收集細胞，冰PBS液漂洗3次，加入Trizol提取細胞總RNA并檢測其濃度和純度，-80 ℃冰箱保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)終體積 20 μL，42 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃保存。引物設(shè)計 利用NCBI在線引物設(shè)計工具設(shè)計ERα、ERβ及內(nèi)參GAPDH的引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。GAPDH序列：上游AACGACCCCTTCATT,GACCT下游CCCCATTTGATGTTAGCGGG，產(chǎn)物長度164 kb；ERα：上游ACACCATCGATAAGAACCGG，下游TTCGGCCTTCCAAGTCATCT，產(chǎn)物長度153 kb；ERβ上游ATCTGTCCAGCCACGAATCA，下游CCGTTTCTCTTGGCTTTGCT，產(chǎn)物長度197 kb。實時熒光定量PCR反應(yīng) 以反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA 為模板，參照VazymeAceQ qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，35～40個循環(huán)，根據(jù)擴增曲線和溶解曲線，利用2-△△Ct法進行統(tǒng)計處理。采用比較2-△△Ct法分析ERα、ERβ mRNA的相對表達量。以GAPDH作為內(nèi)參基因計算各組△Ct值(即Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)，組間比較得到△△Ct 值(即兩組△Ct值相減)，通過2-△△Ct值分析組間比較目的基因的變化：2-△△Ct≥2，組間比較目的基因表達明顯增高；2-△△Ct≤0.5，組間比較目的基因表達明顯降低。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0 For Windows統(tǒng)計軟件包，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。計量資料采用方差分析，計數(shù)資料采用秩和檢驗。若P≤0.05則表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一貫煎對HSC-T6細胞增殖的影響

與空白組比較，作用24 h后，雌二醇組及一貫煎高劑量組表現(xiàn)出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05)；作用48 h后，雌二醇組、一貫煎各劑量組均表現(xiàn)出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05),且兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；作用72 h后，一貫煎高劑量組的抑制增殖作用優(yōu)于雌二醇組(P<0.05)。 見表1。

表1 一貫煎對HSC-T6細胞增殖的影響

注：與空白組比較，△P<0.05；與雌二醇組比較，*P<0.05。

2.2 一貫煎對HSC-T6細胞上清液Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的影響

培養(yǎng)48 h后，與空白組比較，一貫煎各劑量組均能降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的含量(P<0.05)；與雌二醇組比較，一貫煎高、中劑量組的Ⅰ型膠原含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但在降低Ⅲ型膠原含量方面，一貫煎高劑量組呈現(xiàn)明顯的優(yōu)勢(P<0.05)。見表2。

表2 HSC-T6細胞上清液中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的含量比較

注：與空白組比較，△P<0.05;與雌二醇組比較，*P<0.05。

2.3 一貫煎對HSC-T6細胞ERα、ERβ mRNA表達的影響

HSC-T6細胞加入各含藥血清培養(yǎng)48 h后，提取總RNA，進行RT-PCR。與空白組相比，雌二醇組、一貫煎高劑量、中劑量及低劑量組均可明顯提高ERα、ERβ mRNA表達(P<0.05)；一貫煎各劑量組較雌二醇組ERα、ERβ mRNA表達降低(P<0.05)。見表3。

表3 一貫煎對HSC-T6細胞ERα、ERβ mRNA表達的影響

注：與空白組比較，△P<0.05；與一貫煎低劑量組比較，▲P<0.05；與一貫煎高劑量組比較，*P<0.05。

3 討論

HSC是肝細胞和竇內(nèi)皮細胞之間的內(nèi)皮下間隙非游走的竇旁細胞，在慢性肝損傷過程中，HSC受到各種刺激后活化，活化后的HSC表現(xiàn)出難以逆轉(zhuǎn)的高增殖性、高分泌性和永生性特征，分泌大量的細胞外基質(zhì)(主要為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原)，是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此抑制HSC活化，可有效地減輕或逆轉(zhuǎn)肝纖維化[6]。

雌激素受體(estrogen receptor,ER)是一種糖蛋白，屬于甾體激素受體超家族成員，主要有ERα和ERβ兩種亞型，在心肌纖維化、腎間質(zhì)纖維化、肺纖維化等纖維化疾病中，雌激素通過與ER結(jié)合，激活雌激素應(yīng)答元件(estrogen responsive element，ERE)基因的表達，不同程度的發(fā)揮抗纖維化和保護器官功能的作用。研究發(fā)現(xiàn)[4-5],接受雌激素替代治療的絕經(jīng)女性發(fā)生肝纖維化的幾率比未接受治療的絕經(jīng)女性要低。動物實驗也證實雌二醇具有抗肝纖維化作用可能與通過抑制TGF-β/NF-κB信號通路、抑制肝星狀細胞活性有關(guān)[6-9]；ERβ激動劑可改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化的發(fā)生[10]。雷洛昔芬(雌激素受體調(diào)節(jié)劑)可能通過調(diào)節(jié)HSC表面的ERα改善高脂飲食誘導(dǎo)的卵巢切除雌性大鼠的肝纖維化[11-12]。林柳兵等發(fā)現(xiàn)，具有ER調(diào)節(jié)劑作用的柴胡皂苷d可提高肝星狀細胞ERα和ERβ mRNA的表達，抑制肝星狀細胞的活化[13-15]。因此，有效調(diào)節(jié)HSC的ER有利于延緩肝纖維化進展。

肝纖維化可歸為“癥積”范疇，歷代醫(yī)家對肝纖維化的病因病機有不同的觀點。性激素可歸屬于“腎精”范疇，絕經(jīng)后女性生理特性為“腎氣虛，天癸竭”，其發(fā)生肝纖維化被認為是肝腎同病。明代秦景明在《癥因脈治》中明確提出“乙癸同源，肝腎同治”，這一治療原則在李中梓《醫(yī)宗必讀》“東方之木，無虛不可補，補腎即所以補肝；北方之水，無實不可瀉，瀉肝即所以瀉腎”中得到透徹地闡發(fā)?！案文I同治”基本治則為 “滋水涵木”。通過“滋水涵木”以維持“腎精-肝血”相生、“閉藏-疏泄”統(tǒng)一和“生發(fā)-涵養(yǎng)”協(xié)調(diào)[14]。因此基于“肝腎同源”理論，從腎調(diào)治，以協(xié)調(diào)肝主生發(fā)與腎主涵養(yǎng)的調(diào)控體系，在絕經(jīng)后女性肝纖維化治療中應(yīng)用補益肝腎藥物，可提高臨床療效。

“一貫煎”是肝腎同治的代表方，出自清代名醫(yī)魏玉璜的《續(xù)名醫(yī)類案》，由生地黃、沙參、枸杞、麥冬、當歸、川楝子等6味藥組成，該方有滋養(yǎng)肝腎、疏肝理氣之功。本方用一味疏肝藥川楝子以調(diào)肝木之橫逆，配入大量養(yǎng)陰藥之中，寓疏于補，肝腎同治，是滋陰養(yǎng)肝，疏肝開郁的常用方,既符合肝腎同源的醫(yī)理，又暗含滋水涵木的契機,魏玉璜認為一貫煎“可通治吞酸疝瘕一切肝病”。

有研究表明,一貫煎為主的復(fù)方可改變卵巢早衰大鼠卵巢和垂體形態(tài),并可恢復(fù)卵巢周期性功能[16]。亦有研究也表明,一貫煎加減方能減輕肝腎陰虛型圍絕經(jīng)期綜合征婦女的更年期癥狀，且可升高血清中雌激素水平[17]。一貫煎具有明確的抗肝纖維化作用，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一貫煎可以抑制肝星狀細胞活化、抑制膠原的合成，促進過度增生的膠原纖維的降解，抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化的形成[18]。一貫煎拮抗四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化的機制，可能與調(diào)節(jié)肝組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-1的含量，促進膠原纖維降解有關(guān)[19]。研究也發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯片加用一貫煎后，可顯著改善乙肝肝硬化患者的中醫(yī)癥狀及肝臟纖維化程度[20-21]。

本研究從雌激素受體角度，觀察在“肝腎同源”理論指導(dǎo)下的一貫煎對肝星狀細胞增殖及膠原含量的影響，進一步探討一貫煎在改善絕經(jīng)后女性肝纖維化的作用機制。從細胞學(xué)角度提示，一貫煎含藥血清能夠抑制HSC-T6細胞增殖，降低細胞上清液中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量，提高HSC-T6細胞ERα、ERβ mRNA的表達。此結(jié)果表明,一貫煎抑制肝星狀細胞增殖的作用靶點之一可能為肝星狀細胞的雌激素受體，同時也為一貫煎抗肝纖維化的“肝腎同治”提供了實驗依據(jù)。