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    艾炷灸命門穴對(duì)衰老模型大鼠腦組織中AGEs、RAGE表達(dá)影響*

    2020-04-22 04:43:34蔣云芳趙彩嬌韋日鋪黃逸珠盧美靜
    針灸臨床雜志 2020年2期
    關(guān)鍵詞:命門穴艾炷命門

    蔣云芳,趙彩嬌,韋日鋪,黃逸珠,盧美靜

    (廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001)

    人口老齡化是個(gè)日益嚴(yán)峻的社會(huì)問(wèn)題,許多與衰老早期相關(guān)的疾病如心臟病、高血壓、腦梗塞等心血管疾病及阿爾茨海默、帕金森等神經(jīng)退行性變疾病的發(fā)病率在逐年增長(zhǎng),這些與增齡相關(guān)的疾病不僅會(huì)加速衰老的進(jìn)程,也使老年人的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降,給家庭與社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advance dglycation end products,AGEs)是體內(nèi)生物大分子(蛋白、核酸等)與糖非酶促反應(yīng)的最終產(chǎn)物,它的存在與衰老及衰老早期疾病有著密切聯(lián)系,是衰老的重要生物學(xué)標(biāo)志[1]。艾灸療法具有操作簡(jiǎn)便、安全可靠、效果顯著、無(wú)或少副作用、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì),查閱古今文獻(xiàn)可知艾灸的干預(yù)能夠延緩衰老,但其延緩衰老的機(jī)制有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。故本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖致大鼠衰老模型為研究對(duì)象,選取命門穴進(jìn)行艾炷灸干預(yù),應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的蛋白組學(xué)技術(shù)檢測(cè),觀察大鼠腦組織中AGES、受體RAGE及RAGE mRNA表達(dá)水平影響,探討艾炷灸延緩衰老的機(jī)制,進(jìn)一步為艾炷灸命門穴延緩衰老提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    本實(shí)驗(yàn)采用健康SD雄性大鼠共40 只,月齡在42~49天,體質(zhì)量200~250 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證編號(hào)為:SCXK(湘)2016-0002。將所有大鼠放在每天光照與黑暗各12 h(光照時(shí)間為7:00—19:00)、室溫18~22℃的實(shí)驗(yàn)室條件下,進(jìn)行飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)期間給大鼠自由進(jìn)食和自由飲水。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中,遵照國(guó)家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的要求對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處置。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

    D-半乳糖(Sigma公司);膜蛋白、核蛋白和胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(上海生工,Cat. C510002);Rat Advanced Glycation End Products (AGEs) ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司);Rat advanced glycosylation end product-specific receptor (AGER)ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司);艾炷采用艾絨(豐陽(yáng)艾條公司)制成,制作方法:將艾絨捻成直徑約3 mm、高6 mm的艾炷,每個(gè)艾炷稱為1壯,質(zhì)量約30 mg/壯。

    1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

    Centrifuge 5810R離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 公司);MDF-H73865 醫(yī)用低溫箱(-80℃)(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社);BCD-210DCM 冰箱(青島海爾股份有限公司);TissueLyser LT勻漿儀(Qiagen,GER);微量移液器(德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品);SW-CJ-IFD 潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品);DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(海鴻都電子科技有限公司產(chǎn)品);FA2204B電子秤(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品)。

    1.4 動(dòng)物分組

    將所有健康雄性SD大鼠(共40只)進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,1周后隨機(jī)分組,其中A組(空白組)10只、剩余30只大鼠均用于制備衰老模型,模型制備成功后隨機(jī)選取20只大鼠分為B組(模型對(duì)照組)、C組(命門穴治療組),每組各10只。

    1.5 衰老大鼠模型的建立

    大鼠造模參照崔氏[2]造模的方法,模型制備組采用D-半乳糖溶液(按照1g D-半乳糖加入10 mL生理鹽水的比例配備D-半乳糖溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用)進(jìn)行腹腔注射造模,每天注射1次,注射劑量參照大鼠的體重而定,標(biāo)準(zhǔn)為500 mg/kg。連續(xù)造模60天后,若大鼠出現(xiàn)明顯的亞急性衰老癥狀,如精神萎靡不振、進(jìn)食減少、肢體溫度偏低、形體趨向于臃腫、行動(dòng)反應(yīng)遲緩、皮膚松弛缺乏彈性、毛色枯黃無(wú)澤等,提示模型制備成功。

    1.6 處理方法

    1.6.1 A組(空白組) 每日空腹稱體質(zhì)量,腹腔注射同體積生理鹽水,每日1次,連續(xù)60天。

    1.6.2 模型制備大鼠 每日空腹稱體質(zhì)量,秤質(zhì)量后進(jìn)行腹腔注射制備成亞急性衰老模型。模型制備成功后隨機(jī)選取20只大鼠分為B組(模型對(duì)照組)、C組(命門穴治療組),每組各10只。

    1.6.3 造模后處置 A組(空白組):繼續(xù)正常喂養(yǎng),不作其他處理。B組(模型對(duì)照組):繼續(xù)正常喂養(yǎng),不作其他處理。C組(命門穴治療組):采用艾炷灸命門穴進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)者一人左手拇指和食指抓住大鼠頸部皮膚,使大鼠呈俯臥位,右手固定大鼠一邊大腿及尾部,另一人固定另一邊大腿并進(jìn)行治療操作,命門穴的定位參照黃氏選穴方法[3]選取。施灸前先剪去施灸部位的體毛,然后再用少量蘆薈汁涂抹,將艾炷安放固定好后,用線香點(diǎn)燃艾炷進(jìn)行無(wú)瘢痕直接灸,當(dāng)大鼠出現(xiàn)肢體扭動(dòng)、劇烈掙扎時(shí)迅速用鑷子移走艾炷,每次連續(xù)灸3壯,每日1次,共4周。

    1.7 標(biāo)本采集

    各組大鼠水迷宮結(jié)束后第2天開始采集標(biāo)本,采集標(biāo)本前禁食12 h,大鼠麻醉后處死立即于冰臺(tái)上快速取腦組織,用勻漿儀制備腦勻漿,放入-80℃冰箱貯存。

    1.8 觀察指標(biāo)測(cè)定

    1.8.1 大鼠行為學(xué)檢測(cè) 全部組在治療結(jié)束后第1天開始采用Morris水迷宮檢測(cè)法[4]進(jìn)行水迷宮測(cè)試。檢測(cè)前先在水池中放置平臺(tái),平臺(tái)置于某一象限的中間,然后往池中注入清水,至水面高出平臺(tái)2 cm為止,水溫控制在(21.0±1.5)℃左右,將大鼠面向池壁放入水中,4個(gè)象限中的任一象限均可作為入水點(diǎn),4個(gè)象限依次放入,大鼠在水中游泳時(shí)會(huì)主動(dòng)尋找并爬上平臺(tái),其所需的時(shí)間即稱為潛伏期,觀察并記錄潛伏期的時(shí)間長(zhǎng)短作為學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。將大鼠每次入水的最長(zhǎng)游泳時(shí)限設(shè)定為60 s,如果大鼠在60 s內(nèi)未能在水中找到平臺(tái)則將潛伏期記為60 s,這時(shí)需將其引至平臺(tái)并停留10 s,以強(qiáng)化大鼠對(duì)平臺(tái)的記憶能力,每天訓(xùn)練1次,在經(jīng)過(guò)連續(xù)5天的訓(xùn)練后于第6天撤除平臺(tái),將大鼠放入水中游泳,入水點(diǎn)同上,觀察記錄120 s內(nèi)大鼠跨越平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù),數(shù)值越高說(shuō)明其空間探索能力越強(qiáng)。

    1.8.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 測(cè)定大鼠腦組織勻漿中晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE),采用雙抗體夾心法測(cè)定。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。

    1.8.3 RT-PCR 測(cè)定腦組織中RAGE mRNA:使用RNAprep pure Tissue Kit 提取組織總RNA,F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成預(yù)混Mix合成第一鏈cDNA,嚴(yán)格按照試劑盒執(zhí)行,目的基因RAGE與內(nèi)參基因β-actin的引物序列為:Forward Primer(5′→3′)CCCAATGGTTCACTCCTCCTT,Reverse Primer(5′→3′)CACCGGAAAGTCCCCTCAT;每個(gè)PCR反應(yīng)體系包括:2×12.5 μlTalent qPCR PreMix 、上、下游引物各0.75 μL、1 μLcDNA、11 μLddH2O ,采用相對(duì)定量ΔΔCT法,PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性15 s,95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸32 s,40個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制熔解曲線。

    1.9 統(tǒng)計(jì)方法

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 各組大鼠行為學(xué)的表達(dá)情況

    結(jié)果顯示,模型對(duì)照組與空白組比較,模型對(duì)照組比空白組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期時(shí)間延長(zhǎng),穿越平臺(tái)的次數(shù)減少,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。命門穴治療組與模型對(duì)照組比較,命門穴治療組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期時(shí)間減少、穿越平臺(tái)的次數(shù)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。見表1~2。

    表1 水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組大鼠定位航行潛伏期比較

    注:與空白組比較,※P<0.05,※※P<0.01;與模型對(duì)照組比較,★P<0.05,★★P<0.01。

    表2 水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組大鼠空間探索能力情況

    注:與空白組比較,※P<0.05,※※P<0.01;與模型對(duì)照組比較,★P<0.05,★★P<0.01。

    2.2 大鼠腦組織中AGEs、RAGE表達(dá)情況

    結(jié)果可知,模型對(duì)照組與空白組相比,模型對(duì)照組大鼠腦組織勻漿中AGEs、RAGE表達(dá)水平明顯升高,兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);命門穴治療組和模型對(duì)照組比較,命門穴治療組大鼠腦組織勻漿中AGEs、RAGE表達(dá)水平明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

    表3 各組大鼠腦組織中AGEs、RAGE表達(dá)情況

    注:與空白組比較,※P<0.05,※※P<0.01;與模型對(duì)照組比較,★P<0.05,★★P<0.01。

    2.3 大鼠腦組織中RAGE mRNA表達(dá)情況

    結(jié)果可知,模型對(duì)照組與空白組相比,模型對(duì)照組大鼠腦組織勻漿中RAGE mRNA表達(dá)水平明顯升高,兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);命門穴治療組和模型對(duì)照組比較,命門穴治療組大鼠腦組織勻漿中RAGE mRNA表達(dá)水平明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

    表4 各組大鼠腦組織中RAGE mRNA表達(dá)情況

    注:與空白組比較,※P<0.05,※※P<0.01;與模型對(duì)照組比較,★P<0.05,★★P<0.01。

    3 討論

    艾灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分,在延緩衰老、防病保健中發(fā)揮著重要的作用。命門穴是艾灸延衰保健最重要的穴位之一,其位于第2腰椎棘突下凹陷處;命門中的命即指生命,門則指出入通達(dá)之處,故命門穴寓含的意思是生命本源的動(dòng)力出入通達(dá)與維系生命的地方。命門與腎有密切的聯(lián)系,《針灸問(wèn)答·奇經(jīng)八脈解說(shuō)》曰:“再上十四椎,當(dāng)腎正中,為命門穴,乃腎系著脊之處,為督脈之主?!薄睹銓W(xué)堂針灸集成 》中記載命門穴主治“腦虛,旋仆,善忘……”。即說(shuō)明命門穴有防治腦衰老的作用。命門是對(duì)能調(diào)控五臟機(jī)能的先天精氣的概括,而命門穴是命門在人體體表的門戶,通過(guò)艾灸刺激命門穴能激發(fā)先天元?dú)?,溫煦命門相火[5]?!峨y經(jīng)·第三十六難》謂:“腎兩者,皆非腎……右者為命門?!泵T是生命之原,是精神之所舍,原氣之所系,是男子藏精、女子系胞之處。明代張介賓曰:“命門為元?dú)庵?水火之宅,五臟之陰氣非此不能滋,五臟之陽(yáng)氣非此不能發(fā)?!壁w獻(xiàn)可也認(rèn)為命門之火是十二官的功能活動(dòng)的原動(dòng)力。綜合以上醫(yī)家的論述研究可知命門之火是生命的原動(dòng)力,“命門火衰”即是衰老的主要原因,而通過(guò)艾灸命門穴,能夠溫陽(yáng)助火,鼓動(dòng)腎間之動(dòng)氣,化生氣血而溫煦滋養(yǎng)全身,延緩衰老[6]。張燕等在基因調(diào)控層次上研究艾灸命門穴對(duì)炎性衰老的影響,發(fā)現(xiàn)22條與衰老相關(guān)的炎性反應(yīng)基因,在艾灸命門穴后,有19條基因的表達(dá)在治療后總體趨向正常,說(shuō)明艾灸命門穴能調(diào)控炎性基因表達(dá)而起到抑制衰老的作用[7]。這也是本實(shí)驗(yàn)選用命門穴作為干預(yù)手段的依據(jù)。

    AGEs與衰老及衰老早期疾病有著密切的聯(lián)系,在生理?xiàng)l件下,人體體內(nèi)生物大分子與還原糖在無(wú)酶條件下進(jìn)行無(wú)酶縮合反應(yīng),最終形成穩(wěn)定不可逆交聯(lián)體,即晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[8]。AGEs可隨著年齡的增長(zhǎng)在人體各組織器官不斷堆積,導(dǎo)致細(xì)胞組織器官的不斷損傷,最終加速衰老的形成[9];研究證明[10]AGEs與衰老及糖尿病、動(dòng)脈硬化、阿爾茨海默病、白內(nèi)障等增齡性疾病有著密切的關(guān)系;而D-半乳糖作為還原糖中的醛糖,長(zhǎng)期注射可以產(chǎn)生大量的AGEs,如郭妍等[11]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),D-半乳糖衰老模型與自然衰老大鼠心肌內(nèi)AGEs含量均高于成年對(duì)照組。熊愛華等[12]也證實(shí)D-半乳糖衰老模型的腦組織中會(huì)產(chǎn)生大量的AGEs,可降低腦組織中抗氧化能力及引起胞質(zhì)[Ca2+]超負(fù)荷,出現(xiàn)腦細(xì)胞內(nèi)線粒體的損傷引起衰老。由此可推測(cè)D-半乳糖所致衰老模型從AGEs的生成方面是有別于其他衰老模型的。如本研究中模型對(duì)照組大鼠腦組織中AGEs表達(dá)增加,此結(jié)論與上述情況相符。

    AGEs的致病途徑分為直接與間接兩個(gè)方面,AGEs可直接修飾蛋白質(zhì),破壞細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致機(jī)體損傷,加速機(jī)體衰老進(jìn)程;也可通過(guò)與存在于細(xì)胞表面的特異性受體RAGE相互作用,引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)而致衰老[13]。RAGE作為AGEs最重要的受體,AGEs的許多功能是通過(guò)與位于細(xì)胞表面的特異性受體RAGE相互作用所致[14]。AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后,可生成大量的氧自由基,激活炎癥開關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB,使NF-kB核內(nèi)移,介導(dǎo)NF-kB炎癥通路,并誘導(dǎo)產(chǎn)生多種損傷因子,導(dǎo)致細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)的異常,引起機(jī)體損傷,導(dǎo)致衰老加速[15]。AGEs需要受體RAGE降解,故AGEs的大量產(chǎn)生能誘導(dǎo)RAGE表達(dá)水平的上調(diào),本研究結(jié)果顯示,模型對(duì)照組大鼠腦組織中的RAGE及RAGE mRNA表達(dá)較空白組水平升高。

    因此,本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖致衰老模型大鼠作為研究對(duì)象,選取命門穴進(jìn)行艾炷灸干預(yù),觀察大鼠腦組織中AGES、RAGE及RAGE mRNA表達(dá)水平影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示艾炷灸命門穴可以下調(diào)D-半乳糖衰老模型大鼠腦組織中上述指標(biāo)的表達(dá)水平,說(shuō)明艾炷灸命門穴可以延緩衰老,其機(jī)制可能是AGEs的水平下調(diào)減少了對(duì)蛋白的直接修飾及抑制AGEs與特異性配體RAGE結(jié)合而引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)而達(dá)到延緩衰老的目的。

    衰老常伴有學(xué)習(xí)及記憶力下降等表現(xiàn),因此在檢測(cè)大鼠腦組織中的指標(biāo)前采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)衰老大鼠學(xué)習(xí)及空間記憶能力,本研究結(jié)果顯示,D-半乳糖致衰老大鼠會(huì)出現(xiàn)記憶力減退和空間認(rèn)知障礙,而命門穴治療組較模型對(duì)照組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期時(shí)間減少,穿越平臺(tái)的次數(shù)增多,說(shuō)明艾炷灸命門可以改善D-半乳糖衰老大鼠的學(xué)習(xí)及空間記憶力。

    衰老的機(jī)制是多方面、多層次的,AGEs與衰老的關(guān)系早已被證實(shí),而本實(shí)驗(yàn)研究首次驗(yàn)證艾炷灸命門穴可以下調(diào)AGEs表達(dá)水平來(lái)延緩衰老,不僅為艾炷灸延緩衰老提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也提示了AGEs與多種增齡相關(guān)性疾病密切相關(guān),那么艾炷灸命門穴是否也能減少相關(guān)增齡性疾病的發(fā)生及發(fā)展,例如防治糖尿病、動(dòng)脈硬化等,這有待于進(jìn)一步的研究論證。

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