電針對帕金森抑郁模型大鼠腦內單胺類神經遞質含量影響研究

于建軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)是一種與遺傳、環(huán)境、神經系統(tǒng)老化等因素相關的常見的神經退行性疾病。臨床表現有靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙等特征性運動癥狀，亦有精神障礙、便秘、嗅覺障礙、睡眠障礙等非運動伴隨癥狀。其中精神障礙中的抑郁癥狀對患者生活質量的影響比運動障礙更為嚴重。目前普遍認為40%～50%的PD患者合并抑郁[1]。抑郁癥狀會影響患者的治療效果，加重患者運動障礙，加重殘疾率,降低生活質量。但帕金森抑郁(PDD)與原發(fā)性抑郁的發(fā)病機制、臨床表現、對抗抑郁藥的反應不完全相同。PDD的發(fā)病機制尚不清楚，主流認為與內源性生物學改變及外源性環(huán)境因素有關。本研究觀察電針刺激法對PDD模型大鼠腦內單胺遞質多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠120只，雌雄不拘，大鼠平均體質量為(258.12±36.14)g，購入后在實驗室中飼養(yǎng)7天(保證每天12 h光照以及大鼠的正常飲水與攝食，保持清潔的飼養(yǎng)環(huán)境)，待大鼠適應新環(huán)境、狀態(tài)佳后開始實驗。

1.2 主要儀器及試劑

DA放免試劑盒、5-HT放免試劑盒、NE放免試劑盒(解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術研究所)；0.25 mm×25 mm針灸針(貴州安迪藥械有限公司,安迪牌)；G6805-2A型電針治療儀(上海華誼儀器制造廠)。

1.3 造模方法

1.3.1 PD大鼠造模方法 對56只大鼠進行編號，隨機抽出12只做為空白組，剩余的44只均用于造模實驗。對造模組大鼠稱體重計算麻醉藥用量，采用常規(guī)方法麻醉，大鼠麻醉成功后利用腦立體定位儀獲取大鼠腦立體定向圖譜，確定大腦黑質區(qū)位置后，鉆開顱骨，注射器確定靶向位后緩慢注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)。在術后2周，在大鼠腹腔注射阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠旋轉，計數40 min內的旋轉次數。記錄大鼠5 min向健側旋轉的次數以及在40 min之內發(fā)生旋轉的總次數[2]。而后對結果進行計算處理，每分鐘向健側旋轉次數大于7圈，且在40 min內旋轉次數大于280圈的大鼠認為是陽性大鼠，連續(xù)4周進行統(tǒng)分析，每周結果均符合上述要求的大鼠即為PD模型鼠。在本次造模試驗中44只大鼠中共36只大鼠造模成功。

1.3.2 PDD模型制作 待PD模型造模成功后，隨機抽出12只做為6-OHDA模型組，其余24只大鼠利用改進版的Winner慢性不可預見溫和應激法結合孤養(yǎng)法制造大鼠抑郁模型[3]。首先將用于造模的實驗大鼠單獨1個鼠籠飼養(yǎng)，而后通過不定順序的刺激導致大鼠出現應激障礙，其刺激條件包括全天禁食、全天禁水、4℃冷水游泳、懸尾、晝夜顛倒、行為限制以及電擊足底7種應激刺激，整個刺激周期為21天，每種刺激出現3～4次，但是保證1個刺激不能連續(xù)出現兩天，觀察大鼠的行為學變化并進行評價。

1.4 分組與處理方法

56只大鼠中隨機抽出12只做為空白組，在第1次造模成功的36只大鼠中隨機抽出12只做為6-OHDA模型組，將2次造模的24只大鼠分為2組:6-OHDA抑郁模型組12只、電針組12只。

電針組選用“百會”“印堂”“太沖”“三陰交”穴。根據實驗動物針灸穴位圖譜定位，“百會”透刺“印堂”穴，“印堂”穴向下平刺，“太沖”“三陰交”直刺進針，深度為8～10 mm，“百會”與“印堂”“太沖”與“三陰交”接G-66805型電針治療儀，設置電流強度為0.6 mA，頻率為2 Hz，待大鼠頭部和腳趾發(fā)生微顫定為針刺程度上限，電針時間為40 min，每日1次。治療周期為8周，從第5周開始觀察大鼠的行為學變化。其余3組不給予任何處置。

1.5 觀察指標與評價方法

1.5.1 動物行為學觀察指標與評價方法 評價方法主要包括懸尾試驗、糖水偏愛實驗以及強迫游泳實驗。其具體的評價方法[4]為:①懸尾試驗(Tail suspension test,TST)：大鼠尾巴固定于懸空橫桿上，保持大鼠與地面1.5 m高度，統(tǒng)計大鼠在每5 min內的靜止時間，大鼠四肢與頭部相對不動，整個身體晃動的時間劃分到靜止時間。②糖水偏愛實驗(Sucrose preference test,SPT)：大鼠分籠后，在每個鼠籠中放置兩個飲水裝置，在實驗開始的第1天，在兩個容器中均放入含量為1%的蔗糖溶液，在實驗第2天，將其中1個容器中的蔗糖水更換成純凈水。而后禁食水1天，開始糖水消耗實驗檢測，同時給予大鼠等量的1%的蔗糖溶液以及純凈水，正常飼喂24 h后，計算糖水的消耗量，從而確定大鼠的糖水偏愛率，其計算公式為：糖水偏愛率=糖水消耗/綜合體消耗×100%。③強迫游泳實驗(Forced swimming test,FST)：在透明的玻璃缸中放置溫度23～25℃的溫水，放入實驗大鼠進行強迫游泳實驗，游泳時長為6 min，前兩分鐘由于大鼠剛接觸水環(huán)境的一系列應激性行為不計入統(tǒng)計，記錄后4 min大鼠漂浮不動的時間，大鼠靜止時間越長說明抑郁程度越大。在每只大鼠完成試驗后要對實驗用具進行統(tǒng)一的清理，避免影響下一只大鼠的檢測結果。

1.5.2 神經遞質檢測方法 大鼠行為學檢測實驗完成后，將大鼠麻醉處死，快速取出大鼠腦組織，將其進行保存。適時取冷凍保存的腦組織，制備腦組織勻漿樣本，4℃13 000 r/min 離心處理20 min后取上清液利用放射免疫測定方法檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠行為學比較

與空白組比較，6-OHDA抑郁模型組大鼠的懸尾靜止時間與懸浮不動時間明顯延長，糖水消耗率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明6-OHDA抑郁模型組大鼠出現了行動緩慢、反應遲鈍、精神萎靡等抑郁表現。6-OHDA抑郁模型組與6-OHDA模型組各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電針組與6-OHDA抑郁模型組相比，大鼠懸尾靜止時間及懸浮不動時間縮短，糖水消耗率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明電針對帕金森抑郁大鼠的行為學有良好的改善作用。見表1。

表1 各組大鼠行為學比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P>0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

2.2 大鼠腦內DA含量變化

與空白組比較，6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內DA含量均顯著降低(P<0.05)，結合行為學表現說明帕金森模型造模成功。6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電針組與6-OHDA抑郁模型組比較，大鼠腦組織中DA含量升高，經檢驗差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明電針可使帕金森抑郁模型大鼠腦內的多巴胺含量升高。見表2。

表2 大鼠腦內DA含量變化

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P>0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

2.3 大鼠腦內5-HT與NE含量變化

與空白組比較， 6-OHDA模型組、6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內5-HT與NE含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與6-OHDA模型組比較，6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內5-HT與NE含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明帕金森抑郁與5-HT與NE含量降低有相關性。與6-OHDA抑郁模型組比較，電針組大鼠腦組織中5-HT與NE含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明電針法可以提高帕金森病抑郁大鼠腦5-HT與NE的含量。見表3。

表3 大鼠腦內5-HT與NE含量變化

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P<0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

3 討論

PDD是PD患者常伴發(fā)的非運動癥狀,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，有悶悶不樂、悲痛欲絕、自卑、悲觀厭世等情緒癥狀，嚴重者有幻覺、妄想等精神癥狀，因此可出現思維遲緩、缺乏主動性等表現。本研究的研究對象為無溝通能力的大鼠，因此無法表達自己的情緒與精神狀態(tài)，選擇慢性不可預見溫和應激(CUMS)法造模，因為刺激的不可預見性和多變性使之比較現實的模擬人在生活中所遭遇的各種困難。并且經過長期多變和不可預見溫和應激之后，大鼠糖水消耗量的減少反映了抑郁的核心癥狀——對獎賞的反應性下降，即快感缺失[5]。模型引發(fā)的抑郁樣行為可持續(xù)數月,長期服用抗抑郁藥物可糾正并改善這些異常行為,是目前使用最為廣泛的模型[6]。

單胺類神經遞質屬于中樞神經遞質，對神經、內分泌等系統(tǒng)有非常廣泛的調節(jié)作用，并對情感、情緒、應激行為等生理活動產生重要影響。其主要包括5-羥色胺(serotonin，5-HT)和兒茶酚胺(CA)。兒茶酚胺主要指多巴胺(Dopandne，DA)、腎上腺素(Adrenaline，A)和去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)[7]。在中樞神經系統(tǒng)中，5-HT、NE、DA 之間聯(lián)系緊密并且相互作用，三者的平衡失調是引起抑郁癥的重要原因[8]。5-HT是臨床上目前治療抑郁癥的重要靶向因子。腦內5-HT系統(tǒng)的功能異常與抑郁癥的發(fā)病密切相關[9]。NE具有調節(jié)機體情緒、認知等生理功能。有研究表明NE通過去甲腎上腺素轉運體(Norepinephrine transporter，NET)的微調而發(fā)揮作用，在抑郁癥的發(fā)病中可能起著重要作用[10]。DA 作為NE的前體，參與心理應激活動及精神情緒活動，腦內DA含量降低時就會出現情緒抑郁。

PDD在中醫(yī)理論中屬于“顫證”“郁證”合病的一種疾病類型，該病肝腎陰虧為本，風、火、痰、瘀為標，導致髓?？仗摗鈾C郁滯，是本病產生的根本原因。王順教授通過30年針灸臨床與科研實踐，獨出機杼地提出“調神暢情三六九針法”[11-15]。調神暢情最早見于《北堂書鈔·卷一四二》曰:“安慮潤氣，調神暢情”，但書中未有詳載。王教授解釋為使精神順適、情緒歡暢。因在動物實驗過程中，考慮到針刺部位存在的局限性，故在“調神暢情三六九針法”中選取典型代表穴位進行針刺，百會為諸經交會之要穴，又為督脈之大穴，“督脈入絡腦”與腦關系密切，所以人體之精氣可以通過百會散絡于腦。調節(jié)百會穴，可奉養(yǎng)元神，有健腦益髓、益心安神之功。印堂穴位于腦海前庭，為經外奇穴，有安神定驚、醒腦開竅、寧心益智、疏風止痛、通經活絡之功。太沖為足厥陰肝經輸穴、原穴，具有疏肝理氣、通經活絡、平肝熄風、清熱利濕之效。三陰交為足太陰脾經腧穴，為肝脾腎三經的交會穴，有補脾益腎調肝之功效。四穴相配，標本兼治，加強了醒神復常、健腦寧心、安神定志的功效。

本研究結果證實，與空白組大鼠相比,6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內DA含量均顯著降低(P<0.05)，結合行為學表現說明PD模型造模成功。6-OHDA抑郁模型組大鼠出現了行動遲緩、對事物興趣下降等變化，但電針刺激后，其懸尾靜止時間以及強迫游泳懸浮時間顯著縮短，且糖水消耗率升高，說明電針法能夠有效的緩解大鼠抑郁相關的行為學活動。與空白組、6-OHDA模型組相比，6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內5-HT與NE含量均顯著降低(P<0.05)，說明PDD與5-HT和NE含量降低有相關性。這一結果與之前相關研究所證實的抑郁癥發(fā)病與5-HT以及NE等神經遞質的含量異常之間存在緊密聯(lián)系[16]的結果相符合。與6-OHDA抑郁模型組相比電針組大鼠腦組織中5-HT與NE含量升高，說明電針法可以提高PDD大鼠腦內5-HT與NE的含量。

綜上，電針可使PD大鼠腦內DA含量顯著升高、PDD大鼠腦內5-HT與NE水平明顯升高，從而改善抑郁癥狀，值得在臨床中推廣。