2種栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌多樣性的影響

余望寅，姚 冠，扎西拉姆，普 瓊，劉京晶，周 湘

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300）

鐵皮石斛Dendrobium catenatum是蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium植物，其所含的石斛多糖成分具有抗氧化和抑制癌細(xì)胞等藥用活性，使其具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-6]。鐵皮石斛在野外多附生于高大喬木或山石上，適宜其生長(zhǎng)環(huán)境條件通常為海拔800～1 600 m，樹冠透光率約60%，大氣相對(duì)濕度60%～75%，日間溫度20～25℃，夜間溫度10～13℃，日溫差為10～15℃，年均降水量為1 100～1 500 mm。目前，鐵皮石斛已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；斯しN植，常采用溫室控溫控濕栽培于樹皮土壤復(fù)合基質(zhì)等方式[2,7-9]。據(jù)2018年統(tǒng)計(jì)，中國(guó)人工栽培鐵皮石斛的面積已經(jīng)超過6 667 hm2，產(chǎn)量超1萬t[10]。不同的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)鐵皮石斛的有效成分會(huì)產(chǎn)生影響，一般野外環(huán)境更利于鐵皮石斛積累有效的次生代謝物[2,7-11]。因此，近年來越來越多的栽培基地采用模擬野外生長(zhǎng)環(huán)境，將鐵皮石斛附生于立木表面進(jìn)行栽培[7-8]。眾多研究發(fā)現(xiàn)：植物內(nèi)生菌對(duì)于宿主植物的營(yíng)養(yǎng)代謝、抗逆適生和抵御病蟲害等方面都發(fā)揮重要作用[12-16]。蘭科植物通常與菌根真菌共生，鐵皮石斛的多種內(nèi)生真菌具有促進(jìn)組培植株生長(zhǎng)的作用，如鐮刀菌屬Fusarium內(nèi)生真菌可產(chǎn)生赤霉素促進(jìn)鐵皮石斛生物量和氮磷養(yǎng)分的積累等[6,17-20]。此外，分離自鐵皮石斛的內(nèi)生細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)可誘使鐵皮石斛種子萌發(fā)，具備固氮、解磷等功能[10,20-21]。挖掘鐵皮石斛內(nèi)生菌資源，深度解析菌群結(jié)構(gòu)與宿主植株的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，對(duì)于植株種質(zhì)選育、栽培方式改進(jìn)、產(chǎn)量及品質(zhì)提升等都具有積極意義。本研究探討了鐵皮石斛2種人工栽培方式（溫室土壤基質(zhì)培養(yǎng)和露天立木培養(yǎng)）對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響，并對(duì)鐵皮石斛根、莖、葉各部多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與內(nèi)生細(xì)菌種類分布之間的潛在聯(lián)系進(jìn)行了分析，以期為開發(fā)具有促進(jìn)鐵皮石斛適生和營(yíng)養(yǎng)等功能的內(nèi)生細(xì)菌資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植株采集

鐵皮石斛（品系C9）植株取自浙江省杭州市天目山種植基地。該品系具有較強(qiáng)的抗霜凍能力，以防露天立木培養(yǎng)的植株在10℃下受到霜害。于6月花期，采集2種栽培方式下的3年生健康植株，分別為大棚內(nèi)的盆栽植株（土培，相對(duì)濕度50%～75%，溫度15～25℃）和棲于樹干部（馬尾松Pinus massoniana）近野生植株（樹培，霜期130～156 d，年降水量1 390～1 870 mm）。選取生長(zhǎng)狀態(tài)較一致的植株，分別采集其根、莖、葉、花苞、果實(shí)等部分。所采集的鐵皮石斛材料，及時(shí)用自來水沖洗進(jìn)行表面處理，用于后續(xù)的總DNA提取和多糖測(cè)定。

1.2 植株各部位總DNA提取

分別從土培和樹培植株的根、莖、葉、花苞或果實(shí)部分（當(dāng)年新生部分，表面無病斑，每份100 mg）共選取24份樣品。將每份樣品浸沒于5 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，振蕩消毒30 s后，用無菌水振蕩清洗3次，每次30 s左右。晾干后，液氮碾磨，隨后用Takara細(xì)菌基因組提取試劑盒（MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0）提取總DNA。操作步驟按試劑盒手冊(cè)進(jìn)行，為使內(nèi)生菌破壁完全，其中裂解細(xì)胞階段延長(zhǎng)作用時(shí)間至2.0 h。另準(zhǔn)備各部分樣品表面消毒后置于R2A培養(yǎng)基上檢驗(yàn)表面除菌效果，28℃培養(yǎng)2～3 d，無菌落生長(zhǎng)則為消毒操作合格。

1.3 樣品細(xì)菌16S V3～V4可變區(qū)的高通量測(cè)序和結(jié)果分析

細(xì)菌16S V3～V4可變區(qū)（450 bp）為測(cè)序目標(biāo)片段，由杭州沃森生物科技有限公司利用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。用QIIME 2.0軟件去除低質(zhì)量序列，剩余序列按照相似度97%以上進(jìn)行分類操作單元（operational taxonomic unit,OTU）聚類，以豐度最大的序列為代表序列。利用Greengenes數(shù)據(jù)庫（版本13.8）和美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）比對(duì)進(jìn)行序列注釋，并除去注釋為植株葉綠體和線粒體細(xì)胞器16S OTUs信息。統(tǒng)計(jì)各樣品OTU數(shù)量及每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的有效序列數(shù)，計(jì)算相對(duì)豐度（占每個(gè)樣品總序列數(shù)的比例），并進(jìn)行多樣性分析。

1.4 植株根、莖、葉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

將新鮮的土培和樹培鐵皮石斛根、莖、葉（每份樣品鮮質(zhì)量100.0 g）在80℃烘干2～3 d，粉碎后過篩（60目）收集。將每份樣品的粉末分別稱取3份（每份為0.3 g），放置于250 mL圓底燒瓶200 mL水中，100℃水浴加熱2.5 h。將燒瓶?jī)?nèi)樣品進(jìn)行抽濾處理，濾出液體倒入250 mL容量瓶，待冷卻至室溫用水進(jìn)行定容。取5.0 mL濾液與25.0 mL無水乙醇混合后進(jìn)行4℃冷藏1.0 h。樣品離心1.0 h（轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1），棄上清液后加20.0 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，離心 20 min（轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1），重復(fù)2次。棄上清液，加100℃熱水溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中待冷卻至室溫后，進(jìn)行定容。量取樣品溶液0.5 mL，置于10.0 mL具塞試管中，加入蒸餾水0.5 mL以及體積分?jǐn)?shù)為5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再加入濃硫酸5.0 mL搖勻，沸水中加熱20 min后冰浴5 min。以蒸餾水為空白對(duì)照組，分別取200 μL處理液，測(cè)定波長(zhǎng)488 nm處各組的光密度。配置不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)多糖溶液，測(cè)量光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。重復(fù)3次，計(jì)算根、莖、葉各部分多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件DPS對(duì)2種栽培方式下根、莖、葉、花、果各部分的OTUs、多樣性指數(shù)和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行方差分析。利用R軟件制作韋恩圖、熱圖等。同時(shí)，將篩選出來根、莖、葉各部的OTU相對(duì)豐度與相應(yīng)各部多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行逐步回歸分析，篩選出與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)聯(lián)度最高的OTU信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌群的多樣性

2種栽培方式下，鐵皮石斛各組織部位菌群測(cè)序結(jié)果分析顯示，OTU數(shù)量、Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數(shù)，多呈現(xiàn)差異顯著（OTU：栽培方式F1,16=18.405,P=0.000 6;組織部位F3,16=12.638,P=0.000 2。Shannon-Wiener指數(shù)：栽培方式F1,16=2.504,P=0.133 1;組織部位F3,16=6.017,P=0.000 6。Simpson指數(shù)：栽培方式F1,16=84.739,P=0.000 1;組織部位F3,16=34.673,P=0.000 1），說明栽培方式對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響，且內(nèi)生細(xì)菌在植株上的分布呈組織特異性。如表1所示：樹培的植株除根部外，其他葉和莖部分OTU數(shù)量少于土培環(huán)境中的植株；不同組織部分中，葉部、花部的OTU菌群分布數(shù)量較少，根、莖、果的部分?jǐn)?shù)量較多。多樣性指數(shù)方面也呈相似規(guī)律。

表1 2種栽培方式下鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌多樣性Table 1 Diversity of bacterial symbionts of Dendrobium catenatum under two cultivation methods

2.2 鐵皮石斛內(nèi)生菌群門水平上多樣性分析

由圖1可見：厚壁菌門Firmicutes（16.7%～34.9%）、擬桿菌門Bacteroidetes（8.7%～35.6%）、變形菌門Proteobacteria（15.9%～42.0%）、放線菌門Actinobacteria（2.6%～19.0%）在各組織部位相對(duì)豐度較高。厚壁菌門在土培的莖部占比最高（34.9%），與樹培莖部（31.3%）相近。擬桿菌門在土培葉部最高（35.6%），為樹培葉部（21.7%）的1.6倍。放線菌門在樹培根部最高（19.0%），是土培根部（14.1%）的1.3倍。酸桿菌門Acidobacteria在樹培果實(shí)部位占比最高，達(dá)10.9%，但在葉部和花苞部未檢出。

2.3 鐵皮石斛具固氮潛能的共生菌群分析

氮元素是植物生長(zhǎng)所必需的大量元素，自然條件下常呈局部緊缺狀態(tài)。紅螺菌科Rhodospirillaceae中的固氮螺菌屬Azospirillum，弗蘭克菌科Frankiaceae中的弗蘭克菌屬Frankia，腸桿菌科Enterobacteriaceae中的腸桿菌屬Enterobacter，假單胞菌科Pseudomonadaceae的假單胞菌屬Pseudomonas和芽孢桿菌科Bacillaceae的芽孢桿菌屬Bacillus中的部分種類有內(nèi)生固氮功能。這些科屬在鐵皮石斛各組織中都有分布，除了紅螺菌科和弗蘭克菌科不存在于葉部。從2種栽培下鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌功能上看，樹培狀態(tài)下具有這些固氮潛能的OTUs占比明顯高于溫室土培植株（圖2）。

圖1 2種栽培方式下鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌門水平菌群結(jié)構(gòu)Figure 1 Community structure on phylum level of the bacterial symbionts of D.catenatum under two cultivation methods

圖2 2種栽培方式下鐵皮石斛具固氮潛能的內(nèi)生細(xì)菌Figure 2 Nitrogen-fixing bacterial symbionts on family level of D.catenatum under two cultivation methods

2.4 鐵皮石斛內(nèi)生菌群的主要屬種分布特點(diǎn)

從圖3可見：栽培環(huán)境對(duì)組織內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬（相對(duì)豐度大于1.0%）影響較大。棲水菌屬Enhydrobacter在樹培果中占優(yōu)勢(shì)，比例高達(dá)35.2%；甲醇桿菌屬M(fèi)ethylobacterium在土培葉中為優(yōu)勢(shì)菌屬，比例達(dá)35.8%；薄層菌屬Hymenobacter僅在土培葉中分布，占9.9%。擬桿菌屬Bacteroides、雙歧桿菌屬Bifidobacterium、韋榮球菌屬Veillonella在各組織部位中多有分布，在樹培根部、果實(shí)和土培葉部相對(duì)豐度較低；顫螺旋菌屬Oscillospira在樹培莖部分布較少；巨單胞菌屬M(fèi)egamonas在樹培莖部相對(duì)較多，棲熱菌屬Thermus則在土培花苞內(nèi)最多；不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter則存在于樹培和土培的莖部。

2.5 鐵皮石斛根、莖、葉的多糖分析

如圖4所示：鐵皮石斛莖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于葉部和根部。方差分析結(jié)果顯示：2種栽培方式下鐵皮石斛不同部位多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著差異（根：F1,4=11.15,P=0.029；莖：F1,4=9.44,P=0.037；葉：F1,4=39.31,P=0.003），說明栽培方式影響多糖在植株內(nèi)的積累。通過韋恩圖發(fā)現(xiàn)：不同栽培方式對(duì)根、莖、葉菌群結(jié)構(gòu)有明顯影響，其中根部和葉部影響大，共有的OTUs占24%～26%，而莖部共有部分占49%，這些OTUs的分布差異可能與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)間存在一定關(guān)聯(lián)。將2種栽培方式下根、莖和葉優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬相對(duì)豐度（x自變量，x1～x53分別表示不同屬）和各部多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（y因變量）進(jìn)行相關(guān)性分析，得逐步回歸方程y=0.058+29.688x17-4.146x13-0.424x52-0.085x2（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，P＜0.05）。方程中通過逐步回歸篩選出的4個(gè)屬的相對(duì)豐度與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最為密切（系數(shù)絕對(duì)值越大代表其相關(guān)性越高），其中：不動(dòng)桿菌屬（x17）影響最大，其次為假單胞菌屬（x13）、薄層菌屬（x52）和韋榮球菌屬（x2）。

圖3 2種栽培方式下鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌屬水平熱圖Figure 3 Heatmap on genus level of the bacterial symbionts of D.catenatum under two cultivation methods

3 結(jié)論與討論

在門水平上，不同栽培環(huán)境下鐵皮石斛的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門類多集中在厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，且在不同栽培環(huán)境和不同組織中占比有所不同，顯示內(nèi)生細(xì)菌分布受外界環(huán)境和宿主植物組織特異性的影響較大。其中，果實(shí)部位與其他部位差異較明顯，變形菌門和酸桿菌門的種類占優(yōu)勢(shì)，這很可能跟開花和果實(shí)發(fā)育過程中植株表面環(huán)境菌群進(jìn)入果實(shí)內(nèi)部有關(guān)，或與不同組織營(yíng)養(yǎng)成分種類和含量不同相關(guān)。鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌在屬水平上顯示，擬桿菌屬、雙歧桿菌屬和韋榮球菌屬相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)，這些屬中通常包含了常見的植物源乳酸菌，廣泛存在于各類植物中。其中，不同栽培方式下的韋榮球菌屬、棲熱菌屬、顫球菌屬和甲醇桿菌屬差異較大，這很可能與露天樹培環(huán)境復(fù)雜，風(fēng)吹、雨濺、蟲噬等使得環(huán)境中部分菌屬進(jìn)入植株內(nèi)部。氮元素往往是野外自然條件下植株的生長(zhǎng)限制因子，從高通量測(cè)序結(jié)果看，鐵皮石斛具有多種固氮潛能的菌種包括根瘤菌Rhizobiales和弗蘭克菌等[20,22-23]。尤其在樹培環(huán)境中固氮菌占比顯著高于溫室土培植株，這很可能與環(huán)境中氮養(yǎng)分含量多寡有關(guān)，樹培環(huán)境中固氮菌具有促進(jìn)鐵皮石斛植株生長(zhǎng)的可能。

圖4 2種栽培環(huán)境中鐵皮石斛組織多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 4 Polysaccharide contents of D.catenatum under two cultivation methods

植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主植物積累光合產(chǎn)物等糖類物質(zhì)的有益作用在不同植物上多有報(bào)道。例如，甘蔗Saccharum officinarum莖干部的內(nèi)生細(xì)菌具有促植株生長(zhǎng)及糖類產(chǎn)物積累的作用[24]，內(nèi)生熒光假單胞菌利于草本藥用植物蒼術(shù)Atractylodes lancea植株內(nèi)光合產(chǎn)物和多糖的提高[25]。有些內(nèi)生細(xì)菌本身可在植物體內(nèi)合成大量多糖，如分離自禾本科Gramineae芒草Miscanthus sinensis莖稈部的內(nèi)生菌Mucilaginibacter endophyticus可產(chǎn)生多種外分泌多糖[26]。本研究的2種栽培環(huán)境中，鐵皮石斛根、莖、葉各部OTU重疊部分僅為24.2%～49.0%，顯示出內(nèi)生菌群的組織分布差異性。從逐步回歸分析結(jié)果看：僅4個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈相關(guān)性。盡管不同栽培方式下鐵皮石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所差別，但與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)聯(lián)最高的不動(dòng)桿菌屬在2種栽培方式下莖部相對(duì)豐度都達(dá)1.0%，明顯高于根部和葉部。從序列比對(duì)結(jié)果看：該OTU與約氏不動(dòng)桿菌Acinetobacter johnsonii一致，后者是一種革蘭氏陰性反硝化聚磷耐冷菌，其是否與鐵皮石斛C9品系耐冷特性及多糖合成相關(guān)有待進(jìn)一步驗(yàn)證[27]。與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)聯(lián)僅次于不動(dòng)桿菌屬的是假單胞菌屬，但與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。該屬細(xì)菌往往具有固氮、高分子多聚物降解等多種生理功能，鐵皮石斛內(nèi)發(fā)現(xiàn)的這株假單胞菌很可能參與糖類分解代謝，不利于多糖積累。這與蒼術(shù)中發(fā)現(xiàn)的促生假單胞菌的作用不同，說明同屬菌種在不同宿主植物中作用的多樣性。

綜上所述，不同栽培條件對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)有顯著影響，功能上固氮和耐冷等與宿主營(yíng)養(yǎng)和抗逆相關(guān)的屬種變化明顯，說明內(nèi)生細(xì)菌群對(duì)鐵皮石斛適應(yīng)環(huán)境很可能發(fā)揮重要作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐度與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)的4個(gè)OTUs，為進(jìn)一步分析鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌功能與多糖積累之間的關(guān)聯(lián)提供啟示。