奶牛乳腺炎停乳鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

胡宏偉，蔡 元，田 斌，馮海霞，常運(yùn)朝，張 瑩，車(chē)團(tuán)結(jié)，張成虎，＊

（1.蘭州市畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州730050；2.甘肅省生物芯片工程實(shí)驗(yàn)室）

奶牛乳腺炎又叫乳房炎，是由機(jī)械性刺激、病原微生物入侵及化學(xué)物理性損傷等因素所致的危害性很大的疾病，不僅危害著奶牛業(yè)，而且嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，奶牛發(fā)病后可引起產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降，平均每頭牛產(chǎn)奶量降低15%，嚴(yán)重者造成奶牛過(guò)早的淘汰，給奶業(yè)生產(chǎn)造成很大損失。我國(guó)奶牛乳腺炎陽(yáng)性率在46.4%～85.7%，我國(guó)牧場(chǎng)中的乳腺炎80%以上都是由病原微生物引起的，臨床上治療奶牛乳房炎多用抗生素來(lái)防治，大量抗生素的濫用使得細(xì)菌耐藥性明顯上升。本研究在2014年4月至8月，抽取了甘肅省河?xùn)|地區(qū)天水市、蘭州市不同縣區(qū)、河西地區(qū)金昌市部分奶牛場(chǎng)的乳腺炎（包括臨床型和隱形乳腺炎）乳樣323 份，采用6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基（BETA－SSA瓊脂培養(yǎng)基），普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基結(jié)合革蘭染色、鏡檢及生化試驗(yàn)，分離鑒定出乳樣中的停乳鏈球菌；選用臨床常用的10種抗生素對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。分析了甘肅省部分地區(qū)奶牛場(chǎng)乳腺炎停乳鏈球菌對(duì)10中常用抗生素的敏感情況和耐藥現(xiàn)狀，旨在為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 培養(yǎng)箱（南京電器廠生產(chǎn)）、LEICA BME 雙目顯微鏡（德國(guó)萊卡儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（ZHJH－1112上海智城分析儀器制造有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（HERMLE，德國(guó)）。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（10%血清），選擇性培養(yǎng)基（BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基），革蘭染色液等（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 藥敏紙片 慶大霉素、左氧氟沙星、紅霉素、甲砜霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、頭孢曲松拉、克林霉素共10種藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集 采集甘肅省河西地區(qū)金昌市、蘭州市不同縣區(qū)、河?xùn)|地區(qū)天水市部分奶牛場(chǎng)的乳腺炎乳樣，每頭目標(biāo)牛采集一份樣，共計(jì)323份。采樣前乳頭按常規(guī)程序消毒，先用干凈水沖洗，再用75%酒精消毒4個(gè)奶區(qū)和工作人員的手指，酒精棉球擦干，去前兩把乳汁，每個(gè)奶牛取50 mL 乳樣放入離心管內(nèi)，做好標(biāo)記后放入裝有冰塊的采樣箱里12h內(nèi)送檢。

1.2.2 停乳鏈球菌的分離鑒定 采集的323份乳腺炎乳樣分批以5 000r／min離心15min后，移去管中上層液體，留取離心管底部沉淀物，用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)∩鲜龌鞈乙?，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯（10%血清）中，于37 ℃富集培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)物分別劃線(xiàn)接種到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基，BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24h，觀察溶血現(xiàn)象。用接種針挑取BETA－SSA瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)乳白色菌落再次接種到BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)染色、鏡檢初步確定為疑似停乳鏈球菌后進(jìn)行CAMP試驗(yàn)和生化試驗(yàn)。

1.2.3 CAMP試驗(yàn) 在血瓊脂平板上用金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物劃一條直線(xiàn)，然后將鏈球菌培養(yǎng)物劃一條線(xiàn)，與金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的劃線(xiàn)相互垂直，但不要接觸，二者相距3～5 mm，各鏈球菌分離菌劃線(xiàn)間距10～20mm。置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。在兩劃線(xiàn)交界處是否出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)，出現(xiàn)為陽(yáng)性，不出現(xiàn)為陰性。

1.2.4 生化試驗(yàn) 經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢初步鑒定為鏈球菌的純化培養(yǎng)物，根據(jù)屬鏈球菌的生化特征確定鑒定的生化指標(biāo)。用七葉苷、甘露醇、山梨醇、乳糖、棉子糖、海藻糖，水楊苷、菊糖、馬尿酸鈉、6.5%NaCl試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)等生化指標(biāo)進(jìn)行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)嚴(yán)格按照臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）抗細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)的規(guī)范操作。本實(shí)驗(yàn)選擇紙片擴(kuò)散法，將上述方法分離的典型菌株用無(wú)菌生理鹽水稀釋至約1.5×108CFU／mL（采用細(xì)菌計(jì)數(shù)法），接種到MH 瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)平板貼上抗生素（寫(xiě)具體抗生素名稱(chēng)）藥敏紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。菌接種后15min內(nèi)貼完紙片。將平板反轉(zhuǎn)，36±1 ℃孵育18～24h后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，從平板背面測(cè)量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。

圖1 停乳鏈球菌的生長(zhǎng)形態(tài)

圖2 停乳鏈球菌藥敏試驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離、鑒定

普通瓊脂平板上，37 ℃，36h培養(yǎng)后，未見(jiàn)到菌落；在綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上呈直徑0.1～1.0mm，灰白色，表面光滑，邊緣整齊的圓形和卵圓形呈鏈狀排列或成雙排列的小菌落，菌落周?chē)纬刹煌该鞯牟菥G色溶血環(huán)，呈α型溶血；在選擇性培養(yǎng)基BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基上，呈乳白色菌落，菌落直徑為2～3mm，初步判定為疑似菌落。

2.2 CAMP試驗(yàn)

35 ℃培養(yǎng)24h后，劃線(xiàn)交界處無(wú)箭頭樣的溶血區(qū)，為陰性。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中鏈球菌屬生理生化指標(biāo)為判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行生化試驗(yàn)如表1所示，絕大部分菌株符合停乳鏈球菌生化反應(yīng)特性。

表1 生化鑒定結(jié)果

綜合細(xì)菌的形態(tài)特征、鮮血平板上溶血情況以及CAMP、生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果，最終從323 份乳樣中分離出216株停乳鏈球菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：216株分離株對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素表現(xiàn)出明顯耐藥（見(jiàn)表2），耐藥率分別為71.30%、59.26%、52.78%，而對(duì)左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、甲砜霉素高度敏感，抑菌環(huán)明顯（見(jiàn) 圖2），敏 感 率 分 別 為76.39%、73.61%、65.74%、64.35%。（見(jiàn)圖3）。

表2 216株停乳鏈球菌耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 停乳鏈球菌對(duì)10種藥物的耐藥率

3 討論

3.1 分離手段多樣，羊品采集量大

停乳鏈球菌作為奶牛乳腺炎的致病菌之一，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害很大，同時(shí)對(duì)人體健康也帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。本文通過(guò)對(duì)甘肅省蘭州市，河西地區(qū)金昌市、河?xùn)|地區(qū)天水市的部分奶牛場(chǎng)患乳腺炎奶牛共抽取323份乳腺炎乳樣（包括臨床型和隱形乳腺炎）。采用6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)（BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基），普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，結(jié)合革蘭染色、鏡檢，對(duì)可疑菌落分離純化后進(jìn)行生化試驗(yàn)，最終從323 份乳樣中分離出216株停乳鏈球菌。

3.2 藥敏程度在實(shí)驗(yàn)地表現(xiàn)各異

目前，由于抗生素的濫用使得細(xì)菌的耐藥性十分嚴(yán)重，本研究選用了抽樣奶牛場(chǎng)常用的10種抗菌藥物，將分離到的216株停乳鏈球菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明：分離株對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素表現(xiàn)出明顯耐藥，耐藥率分別為71.30%、59.26%、52.78%，其中對(duì)青霉素耐藥的有154株，對(duì)四環(huán)素耐藥的有128株，對(duì)紅霉素耐藥的有114株，說(shuō)明上述三種抗菌藥物在臨床中被長(zhǎng)期大量濫用，導(dǎo)致停乳鏈球菌已對(duì)上述三種抗菌藥高度耐藥，耐藥性非常嚴(yán)峻。

3.3 應(yīng)減少或停用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥

提醒該地區(qū)牛場(chǎng)今后繼續(xù)用β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，如：青霉素、頭孢曲松鈉；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，如紅霉素，或用四環(huán)素類(lèi)抗生素來(lái)對(duì)抗停乳鏈球菌已沒(méi)有實(shí)際意義。而分離株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物左氧氟沙星，多肽類(lèi)抗生素萬(wàn)古霉素、氨基糖苷類(lèi)慶大霉素、以及酰胺醇類(lèi)抗菌藥甲砜霉素表現(xiàn)出較高的敏感性，敏感率分別為76.39%、73.61%、65.74%、64.35%，敏感株有124株、165株、142株、139株。

3.4 建議

建議當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)在治療以停乳鏈球菌為主要致病菌的乳腺炎疾病時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮用喹諾酮類(lèi)、多肽類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物，同時(shí)建議當(dāng)?shù)孬F醫(yī)臨床可交替使用抗菌藥或通過(guò)借助藥敏試驗(yàn)制定聯(lián)合用藥方案，要科學(xué)、合理地使用抗菌藥物。

4 小結(jié)

本研究通過(guò)分離鑒定甘肅省部分地區(qū)乳腺炎乳樣中的停乳鏈球菌，以及通過(guò)藥敏試驗(yàn)對(duì)分離株的耐藥現(xiàn)狀進(jìn)行了分析，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)及時(shí)掌握病情，同時(shí)對(duì)當(dāng)?shù)孬F醫(yī)臨床正確、合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］ Denis M，Wedlock D N，Lacy－Hulbert S J，et al.Vaccines against bovine mastitis in the New Zealand context；what is the best way forward［J］.N Z Vet J，2009，57（3），132－140.

［2］ Taverna F，Negri A，Piccinini R，et al.Characterization of cellwall associated proteins of a Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis case by aproteomic approach［J］.Vet Microbiol，2007，119（2－4）：240－247.

［3］ 周利青，王文魁，奶牛乳房炎的研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2005（5）：8－9.

［4］ 朱戰(zhàn)波，王紅，劉宇，等.奶牛乳房炎鏈球菌分離株的鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2007（12）：8－10.

［5］ 白龍，郝永清，范利霞，等.奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌的分離鑒定［J］.畜牧與飼料科學(xué)2010，31（1）：96－97.

［6］ 李新圃，張禮華，李宏勝，等.奶牛乳房炎主要致病菌的藥敏試驗(yàn)［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，1995，25（9）：27－28.

［7］ 劉春杰，楊麗華，張春，等.長(zhǎng)春地區(qū)奶牛乳腺炎主要致病菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.南方農(nóng)業(yè)，2014，8（18）：155－156.

［8］ 馬保臣，李建基，劉錫武.奶牛急性乳腺炎病原菌的分離與鑒定研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2003（1）：35－36.

［9］ 陸承平，獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.

［10］ Khan A，Dass C，Ramamurthy T，et al.Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin producing Escherichia coli isolates from diverse sources in calcutta［J］.JClin Microbiol，2002，40（6），2009－2015.

［11］ 王禮偉，楊亞?wèn)|，屈勇剛，等，新疆石河子地區(qū)奶牛乳房炎鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（2）：124－127.

［12］ 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社.2001：248－249.

［13］ Erskine R J，Walker R D，Bolin C A，et al.Trends in Antibacterial Susceptibility of Mastitis Pathogens During a Seven－Year Period［J］.Dairy Sci，2002，85：1111－1118.