非諾貝特對非酒精性脂肪性肝病小鼠模型腸道菌群多樣性的影響

張 丹， 周 波， 鄧 溢， 文 玉， 呂俊衍， 王金香， 耿坐濤， 羅粟風(fēng)， 應(yīng)昀晏， 文代艷， 施春晶， 普光宇， 姜 鑫， 馬嵐青

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 昆明 650032； 2 昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 昆明 650500；3 麗江市兒童醫(yī)院 普外科， 云南 麗江 530721

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他確定的損傷因素外所導(dǎo)致的臨床病理綜合征，主要特征為肝細胞內(nèi)脂肪過度堆積。包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、相關(guān)肝硬化和肝細胞癌[1]。NAFLD不僅會影響患者的肝膽系統(tǒng)，還與胰島素抵抗、血脂紊亂、動脈粥樣硬化、脂肪栓塞、血液系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)[2]。隨著生活水平的提高，NAFLD的發(fā)病率逐年提高且呈低齡化[3]。據(jù)估計，世界范圍內(nèi)NAFLD的發(fā)病率為25%[4]，在我國一線城市NAFLD的發(fā)病率為15%[5]。面對NAFLD的現(xiàn)狀，對NAFLD的預(yù)防及治療的研究顯得尤為重要。

非諾貝特是一種纖維酸衍生物，其作為過氧化物酶體增殖物激活受體亞型 α(PPARα)的合成配體，能刺激脂肪分解，被廣泛用于治療高甘油三酯血癥、血脂異常、糖尿病等代謝性疾病[6-7]。眾多文獻[8-10]證實，PPARα與NAFLD關(guān)系密切，PPARα激動劑可通過刺激脂肪酸氧化、改善脂蛋白代謝有效改善NAFLD。

一系列研究[11]表明，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變及過度生長等都是NAFLD發(fā)生的原因，而恢復(fù)腸道菌群平衡、降低其通透性可改善NAFLD的進展。近年來，Illumina 高通量測序等前沿技術(shù)的應(yīng)用使得腸道菌群與NAFLD的聯(lián)系得以更深入的研究。腸道菌群可通過腸肝軸影響NAFLD的發(fā)展[12]，腸道菌群還可能改善NAFLD的組織學(xué)特征，包括脂肪變性，炎癥和纖維化；臨床研究[13]也發(fā)現(xiàn)NAFLD患者的腸道菌群與正常人相比發(fā)生組成變化。腸道菌群失調(diào)已成為NAFLD發(fā)病的重要原因之一，糾正腸道菌群失調(diào)可以預(yù)防和減輕NAFLD的發(fā)生發(fā)展，NAFLD同樣也可以影響腸道菌群的數(shù)量和質(zhì)量[14]。

益生菌、益生元及抗生素等可調(diào)控腸道菌群[15-16]，同時有研究[17-18]得出，蝦青素、康普茶等減輕NAFLD可能是通過影響腸道菌群。這些均提示NAFLD與腸道菌群有著密切的聯(lián)系，但是目前尚未有關(guān)于非諾貝特對NAFLD的治療作用與腸道菌群關(guān)系的研究報道，故本研究旨在探討非諾貝特治療NAFLD后小鼠的腸道菌群多樣性變化，為非諾貝特治療NAFLD的機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物試劑 非諾貝特(貨號：F6020)購自美國Sigma公司；羧甲基纖維素鈉(貨號：C8621)購自北京索萊寶公司，用0.5%的羧甲基纖維素鈉將非諾貝特制為混懸液，濃度為4 g/L；油紅O染色試劑盒(貨號：G1261)、蘇木精伊紅染色試劑盒(貨號：G1261)均購自索萊寶公司。高脂飼料自制(總熱量為25.07 kJ/g，其熱比為蛋白質(zhì)20%、碳水化合物20%、脂肪60%)；普通飼料購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 實驗動物 6周齡C57BL/6雄性小鼠30只，SPF級，體質(zhì)量21.50～22.50 g，購自南京生物醫(yī)藥研究院[許可證號: SCXK(蘇) 2015-0001]，恒溫20℃±2℃及濕度50%±5%條件飼養(yǎng)，人工照明明暗各12 h，自由進食水，并每周監(jiān)測小鼠體質(zhì)量變化情況。

1.1.3 儀器與設(shè)備 組織包埋機、組織切片機均為日本櫻花牌；Leica顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與NAFLD小鼠模型的制備 普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分組，分為正常組(N組)、高脂組(H組)及非諾貝特治療組(P組)，每組10只。正常組持續(xù)給予普通飼料，其他組給予高脂飼料，飼料量為每只小鼠(5±1) g/d，持續(xù)喂養(yǎng)10周建立NAFLD小鼠模型。非諾貝特治療組在高脂干預(yù)滿10周后，開始給予非諾貝特，劑量為40 mg·kg-1·d-1，持續(xù)灌胃給藥4周。3組小鼠在滿14周后，禁食12 h，收集糞便，異氟烷吸入麻醉后脫頸椎處死并迅速取肝組織進行固定。

1.2.2 肝組織HE染色及油紅O染色 用10%中性甲醛溶液固定肝組織，脫水、包埋、4 ℃保存，進行常規(guī)HE染色；取新鮮肝組織做冰凍切片，利用油紅O染色試劑盒，光鏡下觀察小鼠肝臟脂肪變性情況。

1.2.3 小鼠腸道生物群落多樣性分析 Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU(operational taxonomic units)聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，可以進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度進行檢測；基于分類學(xué)信息，可以在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計。在上述分析的基礎(chǔ)上，可以進行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析，以上過程均由美吉生物公司完成。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化情況 實驗過程中各組小鼠狀態(tài)均良好，食欲佳，性情溫順，飲水和尿量均無明顯差異，活動正常。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠平均體質(zhì)量為(22±0.15)g；高脂飲食干預(yù)4周時，H組、P組小鼠體質(zhì)量較N組有輕微增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)飲食4周后，H組與P組小鼠體質(zhì)量均呈上升趨勢，且在干預(yù)10周時，H組、P組小鼠體質(zhì)量與N組相比明顯增加(P值均<0.05)；P組高脂飲食10周后開始給予非諾貝特連續(xù)灌胃4周，體質(zhì)量較H組呈現(xiàn)明顯下降趨勢(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況(g)

注:1) 與N組比較，P<0.05；2) 與H組比較，P<0.05。

2.2 肝組織HE染色及油紅O染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，N組肝細胞排列整齊，核大而圓，結(jié)構(gòu)清晰，無脂肪空泡出現(xiàn)；H組肝細胞胞漿內(nèi)廣泛分布大量大小不等的脂肪空泡；與H組相比，P組無明顯空泡狀結(jié)構(gòu)。油紅O染色結(jié)果顯示，N組未見明顯脂滴，H組可見大量橘紅色的脂滴，而P組與H組相比脂滴明顯減少，且與N組相似(圖1)。

注：H組中HE染色結(jié)果顯示脂肪空泡(如黑色箭頭所示)，油紅O染色結(jié)果顯示橘紅色脂滴(如黑色箭頭所示)。

2.3 小鼠腸道微生態(tài)多樣性改變

2.3.1 糞便樣本微生物測序OTU分類結(jié)果 在97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析，經(jīng)Miseq測序后，3組12個樣本總共獲得278 328條優(yōu)化序列、3089個OTUs，平均每個樣本23 194條序列、257個OTUs，其中N組4個樣本，共92 776條序列、1169個OTUs；H組4個樣本，共92 776條序列、968個OTUs；P組4個樣本，共92 776條序列、952個OTUs(表2)。

2.3.2 各組小鼠菌群多樣性情況 Shannon-Wiener是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，其數(shù)值的高低可以表示菌群數(shù)量的變化，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。H組與N組相比，H組菌群Shannon指數(shù)平均值明顯降低，其菌群數(shù)量明顯減少；P組Shannon指數(shù)平均值較N組降低，其菌群豐度減少，但是P組Shannon指數(shù)平均值較H組略增加，其菌群豐度相對增高(圖2)。

圖2 小鼠細菌的Shannon稀疏性曲線

表2 各組小鼠糞便樣品測序結(jié)果及多樣性指數(shù)

2.3.3 各組小鼠菌群結(jié)構(gòu)組成 在門分類學(xué)水平(圖3)，3組樣本中擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)差異最為明顯。厚壁菌門在H組中占比最高，擬桿菌門在N組中占比最高。3組樣本中菌群占比較小的是放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)，其中放線菌門在H組中占比較高，僅次于厚壁菌門；疣微菌門在H組中占比較N組顯著降低；變形菌門在H組中占比較N組顯著增加。

在屬分類學(xué)水平(圖4)，各組菌群的結(jié)構(gòu)組成和菌屬占比存在明顯的差異，在N組中，Muribaculaceae_norank、毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae_NK4A136_group)在腸道菌群中占比最高。與N組相比，H組新增菌屬Dubosiella，同時瘤胃球菌屬(Ruminococcus_1)消失，其優(yōu)勢菌屬的比例也發(fā)生變化：在N組為優(yōu)勢菌群的Muribaculaceae_norank、毛螺菌科NK4A136組的占比均明顯降低，以Muribaculaceae_norank最為明顯；梭菌屬(Clostridium)、Turicibacter、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)成為H組中的優(yōu)勢菌群。與H組相比，P組樣本菌群結(jié)構(gòu)基本不變，而優(yōu)勢菌屬的比例有所變化：梭菌屬、Turicibacter、雙歧桿菌屬占比降低；Faecalibaculum占比增加，豐度僅次于梭菌屬，Muribaculaceae_norank、阿克曼菌屬(Akkermansia)、螺桿菌屬(Helicobacter)、Lachnospiraceae_unclassified占比也有增加。

圖3 門分類水平的分類學(xué)組成分析

圖4 屬分類水平的分類學(xué)組成分析

2.3.4 各組菌群整體結(jié)構(gòu)變化 PCA分析，即主成分分析，樣本組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。H組與N組相比，樣本的距離明顯增加，樣本組成差異性增加；P組與H組相比，樣本的距離縮短，樣本組成差異性降低(圖5)。

圖5 小鼠腸道菌群 PCA 分析

2.3.5 各組菌群差異 為了確定各組小鼠中具有顯著差異的物種，在組間進行LEfSe分析，結(jié)果見圖6。在屬分類水平上，其中Parabacteroides、Muribaculaceae_g_norank、瘤胃球菌屬、毛螺菌屬(Lachnospira)等在N組富集；雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭菌屬、Turicibacter等在H組富集；擬桿菌屬(Bacteroides)、Faecalibaculum、優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)等在P組富集。根據(jù)LDA值大小(LDA>4)，在N組中擬桿菌門、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、霍爾德曼氏菌屬(Holdemania)等占優(yōu)勢，H組中厚壁菌門、梭菌屬、放線菌門、雙歧桿菌科、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、紅蝽菌目(Coriobacteriales)等占優(yōu)勢，P組中擬桿菌門、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)、Acetatifactor、Ruminiclostridium_1等占優(yōu)勢。

3 討論

在本研究中，通過對小鼠體質(zhì)量監(jiān)測、肝組織病理學(xué)觀察再次驗證非諾貝特對NAFLD具有明顯的改善作用，在此基礎(chǔ)上對小鼠糞便進行高通量測序16S rRNA分析菌群的多樣性及差異發(fā)現(xiàn)：非諾貝特可能通過增加如擬桿菌門等菌群的豐度，同時降低如厚壁菌門等菌群的豐度，來達到治療NAFLD的目的。

圖6 LEfSe 多級物種層級樹圖

非諾貝特治療NAFLD的機制尚不清楚，目前的研究發(fā)現(xiàn)非諾貝特主要通過以下途徑對NAFLD起保護作用：(1)通過下調(diào)AKT/FSAN通路和降低活性氧自由基累積達到降低脂質(zhì)累積改善NAFLD的目的[19]；(2)通過IRE1α-XBP1-JNK途徑減輕肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善NAFLD[20];(3)激活PPARα調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝[21];(4)增強脂肪三酰甘油酶活性，增加甘油三酯水解活性，起到治療NAFLD的作用[22]。近年來，越來越多的研究[23-24]表明，腸道微生態(tài)在NAFLD的發(fā)展中起著重要的作用。Lu等[25]和Liu等[26]的研究均表明，以厚壁菌門為代表的有害細菌的數(shù)量減少，以擬桿菌屬為代表的有益細菌的數(shù)量增加可改善NAFLD；Lu等[12]研究提出，有效的調(diào)控腸道菌群， 如乳酸桿菌相對豐度增加、厚壁菌門某些屬相對豐度減少、厚壁菌門/擬桿菌門比值降低與肝脂質(zhì)累積降低可能存在一定的聯(lián)系。同樣臨床上有研究[13]對NAFLD患者的糞便微生物菌群特征進行了檢測，發(fā)現(xiàn)NAFLD中厚壁菌門相對豐度較高。在本研究中，非諾貝特治療的NAFLD小鼠腸道中擬桿菌門豐度增加，厚壁菌門豐度降低，這與以上研究相一致。

本研究中，利用非諾貝特治療NAFLD的同時，觀察了小鼠腸道微生態(tài)的多樣性變化，盡管目前還不清楚在非諾貝特治療NAFLD的過程中，腸道微生態(tài)扮演著怎樣的角色，但這為非諾貝特改善NAFLD的機制研究提供了新思路。究竟是非諾貝特改善了腸道菌群進而改善了NAFLD，還是非諾貝特改善了NAFLD從而恢復(fù)了腸道微生態(tài)，亦或是非諾貝特協(xié)同腸道菌群對NAFLD產(chǎn)生了治療作用，值得進一步研究。