海南西海岸紅樹(shù)林伴生植物內(nèi)生放線菌多樣性及其延緩衰老活性初篩

李蜜 易湘茜 楊彩妮 龐曉婷 姜舒 高程海

摘 要：為尋找新型抗衰老藥物，該文以海南西海岸紅樹(shù)林伴生植物為研究對(duì)象，采用9種不同培養(yǎng)基從7種伴生植物21份樣品中分離純化放線菌，通過(guò)PCR擴(kuò)增，16S rRNA基因序列分析已純化放線菌的多樣性，利用秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans） 模型篩選菌株來(lái)進(jìn)行延緩衰老活性研究。結(jié)果表明：（1）從7種伴生植物21份樣品中共分離到26株海洋放線菌，隸屬于9科15屬，分別為擬諾卡菌屬、短狀桿菌屬、短小桿菌屬、Demequina、戈登氏菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、Lysinimicrobium、細(xì)桿菌屬、假諾卡氏菌屬、微球菌屬、原小單孢菌屬、擬無(wú)枝酸菌屬、Yimella、北里孢菌屬和鏈霉菌屬，其中鏈霉菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。（2）經(jīng)秀麗隱桿線蟲(chóng)模型篩選，發(fā)現(xiàn)有2株海洋放線菌的發(fā)酵粗提物具有延緩秀麗隱桿線蟲(chóng)衰老的作用。綜上結(jié)果說(shuō)明海南西海岸紅樹(shù)林伴生植物中含有豐富多樣的藥用放線菌資源，為海洋放線菌抗衰老研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：伴生植物，物種多樣性，內(nèi)生放線菌，抗衰老活性

Abstract：In order to search for new anti-aging drugs，actinobacteria were isolated from seven associated mangrove plants and nine different isolation media. The strain diversities were analyzed by using PCR amplification and comparison of 16S rRNA gene sequences. The anti-aging activities of the actinobacteria were analyzed by using Caenorhabditis elegans screening models. The results were as follows：（1） A total of 26 marine actinobacteria were isolated from 21 samples of seven associated mangrove plants，belonging to nine families and fifteen genera consist of Nocardiopsis，Brachybacterium，Curtobacterium，Demequina，Gordonia，Nocardioides，Lysinimicrobium，Microbacterium，Pseudonocardia，Micrococcus，Promicromonospora，Amycolatopsis，Yimella，Kitasatospora and Streptomyces，and the dominant genus was Streptomyces. （2） Two kinds of actinobacteria were found to have anti-aging effect by Caenorhabditis elegans screening models. All the above results indicate that there are abundant medical actinobacteria resources in the west coast of Hainan，and the study provides research fundamental data for anti-aging research of marine actinobacteria.

Key words：associated mangrove plants，species diversity，endophytic actinobacteria，anti-aging activity

紅樹(shù)林是熱帶亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，其伴生植物指偶爾出現(xiàn)于紅樹(shù)林最內(nèi)緣或邊緣地帶的海岸、海濱、鹽生或陸生植物，被認(rèn)為是紅樹(shù)林的邊緣物種（陶曙紅等，2016）。近年來(lái)，隨著陸地生物資源的廣泛研究和日漸枯竭，海洋微生物資源備受科學(xué)家們的關(guān)注。許多海洋微生物與海洋動(dòng)植物共生，以獲得生存必需的營(yíng)養(yǎng)（李艷華和張利平，2003）。海南西海岸分布著豐富多樣的紅樹(shù)林植物，為保護(hù)國(guó)家資源建立了多個(gè)紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)，包括儋州新英灣紅樹(shù)林市級(jí)自然保護(hù)區(qū)、臨高文瀾江縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)和臨高彩橋紅樹(shù)林縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)等，為科學(xué)研究提供豐富的研究材料。與其他近海環(huán)境相比，紅樹(shù)林是分離放線菌的理想環(huán)境（洪葵，2013）。目前已發(fā)現(xiàn)22 000多個(gè)微生物活性產(chǎn)物，其中約70%由海洋放線菌產(chǎn)生，具有多種生理活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫等（Manivasagana et al.，2014）。李飛娜等（2017）從澳門(mén)紅樹(shù)林植物中分離到192株內(nèi)生放線菌，其中獲得2株放線菌新種，6株潛在放線菌新種中5株具有抗菌活性。有研究報(bào)道，海洋放線菌ACMA006的發(fā)酵產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性和較好的抑菌活性（袁獻(xiàn)溫和楊瑞麗，2009）。有關(guān)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的藥理活性報(bào)道很多（李菲等，2017;袁獻(xiàn)溫和楊瑞麗，2009），但對(duì)于微生物抗衰老方面的研究則相對(duì)較少。線蟲(chóng)是經(jīng)典模式生物，具有生命周期短、易培養(yǎng)、易觀察、基因組容量小且圖譜清晰等優(yōu)勢(shì)（呂婷，2014），目前已廣泛應(yīng)用到抗衰老藥物的篩選和研究過(guò)程中（呂婷，2014;王艷菊等，2014）。隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人口老齡化已成為當(dāng)前不可阻擋的趨勢(shì)（薛曉利等，2017）。2010年全國(guó)60歲以上的老年人口占人口總數(shù)的13.26%，預(yù)計(jì)到21世紀(jì)中葉，將達(dá)到4.5億，約占總?cè)丝诘?/3（曾爾亢等，2012）。由此可見(jiàn)，抗衰老藥物的研究是當(dāng)前重要而緊迫的任務(wù)（呂婷，2014）。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于線蟲(chóng)延緩衰老模型的研究主要集中于中藥提取物和保健產(chǎn)品的延緩衰老研究（黃正杰等，2013），而關(guān)于利用海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)衰老模型的研究報(bào)道較少。海洋微生物擁有獨(dú)特的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，其代謝產(chǎn)物的抗衰老研究值得深入探討。到目前為止，未見(jiàn)有關(guān)于紅樹(shù)林伴生植物共生微生物多樣性的研究報(bào)道。本研究采用秀麗隱桿線蟲(chóng)作為延緩衰老研究的模式生物，以特殊生境的海洋伴生植物為研究對(duì)象，采用純培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)展其內(nèi)生放線菌多樣性及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)衰老活性的研究，為研究紅樹(shù)林放線菌群落組成提供參考，以及期望獲得強(qiáng)活性菌株，為開(kāi)發(fā)新型抗衰老藥物提供強(qiáng)活性菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為7種伴生植物樣品：海馬齒（Sesuvium portulacastrum）、厚藤（Ipomoea pes-caprae）、魚(yú)藤（Derris trifoliata）、曼陀羅（Datura stramonium）、苦郎樹(shù)（Clerodendrum inerme）、猩猩草（Euphorbia cyathophora）、彎枝黃檀（Dalbergia candenatensis）。材料由廣西中醫(yī)藥大學(xué)高程海研究員鑒定。樣品于2017年7月采集于海南西海岸的紅樹(shù)林，經(jīng)緯度、物種編號(hào)、植物種類(lèi)及組織等信息見(jiàn)表1所示。分別采取花、莖、葉和胚軸，先用無(wú)菌水沖洗樣品表面3遍，立即裝入密封采樣袋，置于采樣冰盒中24 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室;然后進(jìn)行研磨、稀釋涂布、培養(yǎng)。野生秀麗線蟲(chóng)用于本研究抗衰老活性的初步篩選，由廣西科學(xué)院汪斌博士惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 伴生植物樣品的處理 去除伴生植物表面的雜質(zhì)，分別選取完整無(wú)病蟲(chóng)害的花、莖、葉、胚軸進(jìn)行表面消毒，先用5%的次氯酸鈉溶液浸泡8 min，無(wú)菌水沖洗3次;再用75%的酒精溶液浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3次。分離培養(yǎng)基參考李飛娜等（2017）。分別取少量表面消毒后的植物材料約2 g于研缽中充分研磨，吸取2 mL無(wú)菌水與研磨后的漿液混勻，此濃度液作為樣品原液，再依次稀釋到104組織懸液。分別取100 μL 104組織懸液涂布在9種分離培養(yǎng)基（AGG、M4、M5、M7、M9、M10、ISP7、ISP3和M11）上，樣品原液置于4 ℃冰箱暫存。

1.2.2 菌株的分離純化及保藏 參考吳家法等（2017）的方法，分離平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～8周通過(guò)形態(tài)觀察，挑選質(zhì)地致密程度較高，邊緣內(nèi)陷明顯的放線菌菌落在ISP2培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線純化，如有雜菌則進(jìn)行二次純化或多次純化，直至得到單一純凈的菌落，并記錄菌落數(shù)及菌落的形態(tài)特征。獲得純菌株采用Chelex-100法（周雙清等，2010）提取基因組DNA;參照Walsh et al.（1991）的方法進(jìn)行PCR梯度擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，后進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用Bio-RAD凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。Gel Logic 2200 Pro凝膠成像儀檢驗(yàn)條帶合格后委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件整理，利用數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud（http：//www.eztaxon.org/）（Kim et al.，2009）及Blast網(wǎng)站進(jìn)行在線比對(duì);對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)搜索。將純化好的菌株制成20%（V/V）甘油管保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.3 放線菌粗提物的制備 參考覃媚等（2016）的方法，從ISP2 固體培養(yǎng)基上挑取26株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌絲接種到200 mL ISP2液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃、180 r·min1發(fā)酵7 d;離心收集發(fā)酵液，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃?。ㄓ梅?hào)E表示），取上層乙酸乙酯層濃縮備用;菌體（用符號(hào)T表示）用丙酮破壁后甲醇萃取濃縮干燥，收集粗提物，用于線蟲(chóng)抗衰老活性的初步篩選。

1.2.4 線蟲(chóng)的壽命實(shí)驗(yàn) 參考Lakowski & Hekimi （1998）的方法，檢測(cè)26株放線菌發(fā)酵粗提物是否具有延緩線蟲(chóng)衰老的作用。將線蟲(chóng)涂布于含有OP50的NGM（nematode growth media）固體培養(yǎng)基上，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約48 h后可見(jiàn)L4期成熟線蟲(chóng)，此時(shí)線蟲(chóng)可用于實(shí)驗(yàn)（Brenner，1974）。NGM固體培養(yǎng)基（黃正杰等，2013）：Nacl 3 g，蛋白胨 2.5 g，Agar 17 g，去離子水975 mL。121 ℃，20 min，滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降至55 ℃，依次加入CaCl2 1 mL，MgSO4 1 mL，K3PO4 25 mL，5 mg·mL1膽固醇1 mL，混勻后，倒入一次性平板，平板至少放置1 d后可用或置于4 ℃下一個(gè)月內(nèi)使用完畢。

線蟲(chóng)的同期化：取傳代后線蟲(chóng)用約10 mL的M9緩沖液（Na2HPO4 6 g，KH2PO4 3 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，去離子水1 L）重復(fù)清洗到15 mL離心管中，用微孔濾膜過(guò)濾，取下層液體備用。100 mL大腸桿菌發(fā)酵液離心，去掉上清液，備用。取含有大量蟲(chóng)卵的液體滴加于涂布有OP50的NGM平板中心，平板中還需加入一定量的FDU抑制線蟲(chóng)后代的產(chǎn)生。

壽命實(shí)驗(yàn)：將菌體粗提物樣品浸膏溶解于2% DMSO 中，終濃度為100 mg·L1（實(shí)驗(yàn)組），阿維菌素100 mg·L1（陽(yáng)性對(duì)照），DMSO 0 mg·L1（空白對(duì)照）涂布于含有OP50的NGM平板上，每塊平板挑去20條處于L4期的線蟲(chóng)，每組取5個(gè)平板，置于20 ℃下恒溫箱培養(yǎng)，此時(shí)記為壽命實(shí)驗(yàn)第0天。每天觀察并記錄線蟲(chóng)存活的數(shù)量。DMSO在線蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)中的安全劑量為2%，本研究未超過(guò)安全使用劑量，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

活性菌株粗提物液質(zhì)譜圖：取具有延緩線蟲(chóng)衰老活性的菌株粗提物5 mg，配制成一定濃度的溶液來(lái)進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）譜圖掃描，液相色譜柱為 Luna 5u C18（2） 100A 150 mm × 4.60 mm 5 micron，流動(dòng)相為甲醇-水（含0.1%甲酸），流速為1 mL·min1，分析時(shí)間為 50 min，梯度洗脫。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI 源），源噴射電壓（IS）為4 500 V，霧化溫度為180 ℃。根據(jù)質(zhì)譜圖信息分子離子峰，通過(guò)查閱SciFinder來(lái)初步推斷代謝產(chǎn)物類(lèi)型。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖表采用Excel 2013和Graphpad prim 5繪制，通過(guò)DNA Star軟件進(jìn)行序列整理和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及聚類(lèi)分析，DataAnalysis進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹(shù)林伴生植物內(nèi)生放線菌多樣性分析

根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步排重后，選擇62株菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增和序列比對(duì)分析，結(jié)果表明62株細(xì)菌中26株為放線菌，分布于6個(gè)目9個(gè)科15個(gè)屬。26株內(nèi)生放線菌在15個(gè)屬的多樣性分布如圖1所示，鏈霉菌屬（Streptomyces）分離出5株菌，占所分離放線菌株總數(shù)的19.23%。此次研究分離到的稀有放線菌包括擬諾卡菌屬（Nocardiopsis）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、Demequina、戈登氏菌屬（Gordonia）、類(lèi)諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Lysinimicrobium、細(xì)桿菌屬（Microbacterium）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、微球菌屬（Micrococcus）、原小單孢菌屬（Promicromonospora）、擬無(wú)枝酸菌屬（Amycolatopsis）、Yimella、北里孢菌屬（Kitasatospora），占分離放線菌總數(shù)的80.76%。

26株可培養(yǎng)內(nèi)生放線菌的物種組成見(jiàn)表2。

根據(jù)放線菌菌株與典型菌株比對(duì)，16S rRNA基因序列相似性小于98.5%的菌株是新種的可能性為80%（徐麗華等，2007）。16S rRNA基因序列相似性比對(duì)分析結(jié)果顯示菌株IMDGX 6028、IMDGX 6049、IMDGX 6137、IMDGX 6173、IMDGX 6270、IMDGX 6239和IMDGX 6469-1與有效發(fā)表菌株Amycolatopsis niigatensis、Brachybacterium sacelli、Microbacterium saccharophilum、Lysinimicrobium pelophilum、Brevibacterium permense、Nocardiopsis prasina和Yimella lutea的最高相似度分別為97.76%、97.23%、98.15%、98.32%、97.75%、98.44%和98.39%，即這7株菌株有可能為潛在的放線菌新物種。

2.2 26株內(nèi)生放線菌在植物組織、植物種類(lèi)及培養(yǎng)基中的分布

由圖2可知，M7培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)量和多樣性最多，分別為12株放線菌，隸屬于9個(gè)屬;其次是P3培養(yǎng)基，分離得到11株放線菌，隸屬于8個(gè)屬;第三是M4培養(yǎng)基，分離得到9株放線菌，隸屬于7個(gè)屬。其中，M7和M4兩種培養(yǎng)基均含有L-天冬酰胺作為氨基酸來(lái)滿足放線菌的營(yíng)養(yǎng)需求。這三種不同的培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)量和多樣性均較多，可作為今后培養(yǎng)放線菌的首選培養(yǎng)基。M11培養(yǎng)基（棉子糖-組氨酸培養(yǎng)基）分離得到菌株數(shù)量和多樣性均最少，為4株放線菌，隸屬于4個(gè)屬。

從不同植物組織分離得到的放線菌菌株數(shù)量和多樣性結(jié)果見(jiàn)圖3。從莖中分離得到的放線菌菌株數(shù)量和多樣性最多，為18株放線菌，隸屬于12個(gè)屬;其次是葉子分離得到16株放線菌，隸屬于10個(gè)屬;胚軸中分離得到的菌株數(shù)量和多樣性較少。

從圖4可見(jiàn)，H5苦郎樹(shù)植物分離得到13株放線菌，隸屬于8個(gè)屬;H3魚(yú)藤分離得到10株放線菌，隸屬于5個(gè)屬;H7彎枝黃檀分離得到8株放線菌，隸屬于8個(gè)屬。

根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用譜圖信息可知，IMDGX 6193T的代謝產(chǎn)物在3.3 min存在一較明顯的峰，IMDGX 6364T在3.0 min有明顯的峰，分析兩活性菌株的高分辨質(zhì)譜圖可知分子離子峰分別為MS m/z 305.2110和MS m/z 190.1078，根據(jù)SciFinder檢索初步推斷其代謝產(chǎn)物分別為Elsinopirin A （Frank et al.，2018）和N-Methylcalystegine B3（Naoki et al.，1997），其中Elsinopirin A的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖5所示。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)紅樹(shù)林主要分布于海南、廣東、廣西、福建及臺(tái)灣、香港、澳門(mén)等地。紅樹(shù)林相比陸地環(huán)境，強(qiáng)輻射、高鹽和低氧等特殊生境，所蘊(yùn)育的放線菌類(lèi)群豐富，使放線菌具有更高的拮抗性。近年來(lái)，紅樹(shù)放線菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究逐漸增多（吳家法等，2017;李菲等，2017）。許敏等（2016）從廣東湛江紅樹(shù)林植物中分離得到的內(nèi)生放線菌中有3株具有較強(qiáng)殺線蟲(chóng)活性，同時(shí)22.64%菌株具有抗生素合成基因簇。為探索海南西海岸紅樹(shù)林伴生植物內(nèi)生放線菌資源的特征，本研究對(duì)采集的7種伴生植物，利用9種分離培養(yǎng)基，對(duì)樣品各個(gè)部位的內(nèi)生放線菌進(jìn)行分析，共分離獲得內(nèi)生放線菌26株，隸屬于6個(gè)目9個(gè)科15個(gè)屬。植物不同部位，其內(nèi)生放線菌的含量有所不同，莖中分離的放線菌含量最多，葉子中次之，胚軸中最少。海南西海岸海洋生物多樣化，本研究從伴生紅樹(shù)中分離發(fā)現(xiàn)8株鏈霉菌外，還發(fā)現(xiàn)短狀桿菌屬（Brachybacterium）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、戈登氏菌屬（Gordonia）、北里孢菌屬（Kitasatospora）等稀有放線菌，為尋找新抗生素提供豐富菌源。

以線蟲(chóng)為模型測(cè)定26株內(nèi)生放線菌是否具有抗衰老活性。結(jié)果顯示，2株內(nèi)生放線菌Pseudonocardia carboxydivorans和Streptomyces marokkonensis具有顯著延緩線蟲(chóng)衰老的活性，分別歸屬于假諾卡氏屬和鏈霉菌屬。根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用譜圖信息，可知這兩株放線菌分別含有結(jié)構(gòu)類(lèi)似N-Methylcalystegine B3和Elsinopirin A的化合物。據(jù)報(bào)道，Pseudonocardia carboxydivorans可從土壤和植物樣品中分離得到（Navarromartinez et al.，2017），Park et al.（2008）發(fā)現(xiàn)它對(duì)枯草芽孢桿菌類(lèi)可產(chǎn)生抑制作用。Tanvir et al.（2016）通過(guò)HPLC-MS測(cè)試其主要活性次級(jí)代謝產(chǎn)物為酰胺類(lèi)化合物。本研究通過(guò)秀麗隱桿線蟲(chóng)的衰老模型表明兩者均能顯著延緩線蟲(chóng)衰老，具有一定的抗衰老活性。

通常環(huán)境微生物中只有1%能夠被實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（吳家法等，2017）。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)綜合各研究團(tuán)隊(duì)所用的分離培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，用9種不同營(yíng)養(yǎng)成分的分離培養(yǎng)基共得到分布于9個(gè)科15個(gè)屬的26株放線菌，所獲稀有放線菌數(shù)量和種類(lèi)相對(duì)較高，說(shuō)明海南西海岸紅樹(shù)林伴生植物具有豐富的多樣性，為后期放線菌分離方法研究提供可靠依據(jù)，為進(jìn)一步解決人類(lèi)疾病的實(shí)際問(wèn)題，尋找具有延緩衰老藥物提供活性菌株。目前，人類(lèi)對(duì)海洋內(nèi)生放線菌的了解很有限，摸索適合紅樹(shù)內(nèi)生菌研究的方法，盡可能多地分離純化難培養(yǎng)或未培養(yǎng)的微生物仍是當(dāng)前微生物研究的重要內(nèi)容。

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