海南西海岸四種真紅樹根系土壤放線菌物種多樣性及其延緩衰老活性初篩

候師師 李蜜 姜舒 韓敏敏 劉永宏 易湘茜

摘 要：為更好地開發(fā)利用海洋微生物資源積累豐富的放線菌菌種，該文以海南西海岸潮間帶區(qū)域四種真紅樹根系土壤為研究對象，分析了紅樹林根系放線菌物種多樣性組成及其代謝產(chǎn)物活性。該研究以9種不同培養(yǎng)基為分離介質(zhì)，采用純培養(yǎng)方法和三區(qū)劃線法分離純化菌株，結(jié)合放線菌形態(tài)學(xué)特征及其16S rRNA基因序列結(jié)果開展多樣性分析。放線菌發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取，利用秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）測試其延緩衰老活性。結(jié)果表明：（1）共分離獲得22株放線菌，隸屬于4目7科9屬，其中鏈霉菌屬（Streptomyces）為優(yōu)勢菌群，并初步確認IMDGX 6012、IMDGX 6028、IMDGX 6118、IMDGX 6326、IMDGX 6119 5株放線菌可能為潛在的新物種。（2）發(fā)酵產(chǎn)物延緩衰老研究結(jié)果表明，8株放線菌的代謝產(chǎn)物可顯著延長線蟲壽命（P<0.05）;其中，IMDGX 6028和IMDGX 6118作為擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）和短小桿菌屬（Curtobacterium）的潛在新物種，具有極顯著延緩衰老活性（P<0.01），與空白組比較，可分別延長線蟲壽命的22.2%和26.6%。綜上結(jié)果表明海南西海岸真紅樹根系土壤具有豐富的可培養(yǎng)放線菌資源，具有發(fā)現(xiàn)放線菌新物種和延緩衰老活性菌株的潛力。

關(guān)鍵詞：紅樹林，根系放線菌，菌種多樣性，延緩衰老活性

Abstract：Four true mangrove rhizosphere soils in the intertidal zone of the west coast of Hainan were studied to analyze the species diversity composition and metabolite activity of mangrove rhizosphere actinomycetes，in order to accumulate abundant actinomycetes for better exploitation and utilization of marine microbial resources. In this study，seven samples of true mangrove rhizosphere soil were selected as research objects and nine different media were used as the isolation media. Pure culture method and three-zone scribing method were used to isolate and purify the strains. The species diversity composition was analyzed by combinating with the morphological characteristics of actinomycetes and the 16S rRNA gene sequence results. The actinomycete fermentation broth was extracted with ethyl acetate，and its anti-aging activity was tested using Caenorhabditis elegans model. The results were as follows：（1） A total of 22 strains of actinomycetes were isolated，belonging to four orders，seven families and nine genera consist of Amycolatopsis，Curtobacterium，Demequina，Isoptericola，Lysinimicrobium，Microbacterium，Rhodococcus，Sinomonas，Streptomyces，and Streptomyces was the dominant flora of this study with eleven strains isolated，and five strains of IMDGX 6012，IMDGX 6028，IMDGX 6118，IMDGX 6326，IMDGX 6119 were identified as potential new species actinobacteria. The highest similarities among the strains and the effective published strains Amycolatopsis lexingtonensis，A. niigatensis，Curtobacterium albidum，C. cit-reum，Demequina salsinemoris were 97.75%，98.15%，98.32%，98.44%，98.45%，respectively. The above five rhizosphere actinobacteria belong to rare actinobacteria and were preliminarily identified as potential new species. （2） The results of anti-aging of fermentation products showed that the metabolites of eight strains of actinobacteria could signifi-cantly prolong the lifespan of nematodes （P<0.05），including one strains of Curtobacterium，one strains of Demequina，one strain of Sinomonas and five of which were from Streptomyces，indicating that Streptomyces had potential to produce anti-aging active substances. IMDGX 6028 and IMDGX 6118，as potential new species of Amycolatopsis and Curtobacte-rium，had extremely significant anti-aging activity （P<0.01）. When the crude metabolite concentration was 500 μg·mL1，the survival time of C. elegans was increased by 22.2% and 26.6%，respectively，compared with the blank group. The results indicate that there are abundant resources of culturable actinobacteria and the potential to discover new species and anti-aging activity strains in the true mangrove rhizosphere soils in the west coast of Hainan.

Key words：mangrove plants，rhizosphere actinobacteria，species diversity，anti-aging activity

放線菌是挖掘新型次生代謝產(chǎn)物的重要菌種資源。紅樹林處于海岸潮間帶，獨特的理化環(huán)境和豐富的腐殖質(zhì)為創(chuàng)造微生物多樣性提供了有利條件（Sangkanu et al.，2017），已經(jīng)被公認為分離放線菌的理想環(huán)境（Sweetline et al.，2012）。因此，紅樹林放線菌一直是國內(nèi)外科研人員爭相研究的對象。Lee et al.（2014）從馬來西亞熱帶紅樹林沉積物中分離獲得 87株放線菌，其中5株被認為是新種。洪葵研究組從中國8個紅樹林站點采集的112份土壤和99個植物樣品中分離出2 041株放線菌，歸于8亞目11科25屬，部分菌株次生代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗腫瘤、治療神經(jīng)退行性疾病和糖尿病多種藥理活性（Hong et al.，2009）。我國紅樹物種資源豐富，海南島是我國紅樹植物聚集地之一，共有紅樹植物38種（辛欣等，2016）。其中，位于東部海岸的東寨港和清瀾港紅樹林保護區(qū)作為海南最大的紅樹林分布區(qū)，成為熱點研究地區(qū)，已分離出具有抗菌、抗腫瘤及殺線蟲活性的多種菌株（雷湘蘭，2006;黃惠琴等，2013;李靜等，2016）。海南西海岸紅樹林主要分布于臨高、儋州等地，與東海岸相比，西海岸紅樹林面積小，群落類型相對簡單，目前對于該區(qū)域紅樹根系放線菌的研究鮮有報道。加上近年來人類活動對紅樹林資源造成了實際威脅，及時對該區(qū)域紅樹林根系放線菌實現(xiàn)高值化開發(fā)利用，并以此為契機進一步推動西海岸紅樹林生態(tài)系統(tǒng)建設(shè)，對于我國發(fā)展海洋生態(tài)文明具有重要意義。同時對紅樹林根系放線菌種類多樣性的研究，對于我國海洋微生物資源現(xiàn)狀的整體評價也具有一定參考價值。

近年來我國人口呈負增長趨勢，老齡化形勢日益嚴峻，預(yù)計到 21 世紀中葉，老齡人口將高達 4.5 億，占總?cè)丝诘?1/3（曾爾亢等，2012），解決人口老齡化問題刻不容緩。目前臨床用于抗衰老的藥物大多是合成藥物（Messing et al.，2013），存在安全和功效的不確定性，從微生物中挖掘新化合物一直以來受到各國科學(xué)家的青睞。放線菌被認為是最適合挖掘新化合物的微生物之一，從放線菌挖掘獲得的新化合物包括生物堿、類固醇、萜類化合物、聚酮等，這些化合物在人類疾病治療和病蟲害防治均有報道（Singh et al.，2017），然而這些已鑒定化合物對于人體健康保健方面如延緩衰老活性則鮮有報道。本研究對紅樹根系土壤放線菌多樣性進行分析，并通過初步篩選獲得具有延緩衰老表型的放線菌菌株，為后期挖掘具有延緩衰老活性的新化合物提供重要的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅樹林根系土壤樣品 2017年7月從海南西海岸共采集四種真紅樹林植物根系土壤樣品7份，樣品信息如表1所示。用滅菌鏟沿每種紅樹根圍挖取深度為5 cm的土壤樣品，同一種紅樹植物樣品的取樣地點距離均大于100 m，土壤樣品保存于采樣冰盒中并于24 h內(nèi)送回實驗室進行菌株的分離實驗。

1.1.2 線蟲樣品 OP50大腸桿菌（OP50 Escherichia coli）和野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）均由廣西科學(xué)院汪斌博士惠贈。

1.1.3 實驗試劑 Chelex-100樹脂，2×Easy Taq Supermix購于BioRad公司（美國）;16S rRNA基因擴增引物對27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）購于全式金生物技術(shù)有限公司（中國，北京）;5%次氯酸鈉購于朗索醫(yī)用消毒劑有限公司（中國，杭州）;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 紅樹根系土壤放線菌多樣性實驗

1.2.1 培養(yǎng)基配方 分離用固體培養(yǎng)基：參考李家怡等（2017）方法采用AGG、M4、M5、M7、M9、M10、M11、ISP7和ISP3共9種分離培養(yǎng)基，培養(yǎng)基詳細配方見參考文獻。

純化及保藏培養(yǎng)基：改良ISP2固體培養(yǎng)基，包括酵母提取物2.0 g，麥芽提取物2.0 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂20.0 g和海水1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：改良ISP2液體培養(yǎng)基。

1.2.2 紅樹根系土壤樣品的處理方法 參考李菲等（2018）的方法，挑除根系土壤樣品表面的雜質(zhì)，取紅樹植物根須表面附著的土壤2.0 g裝于含有石英砂和20 mL無菌水的錐形瓶中，于搖床中充分搖勻，制成102、103稀釋液。取兩種稀釋液各0.2 mL，分別涂布于9種分離培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱28 ℃下倒置培養(yǎng)2～8周;從涂布培養(yǎng)基中挑選單一菌落，采用三區(qū)劃線法于ISP2培養(yǎng)基上進行分離純化，得到單一純凈的菌落，編號并記錄菌落的形態(tài)特征及菌落數(shù)。將純化好的菌株保藏于20%（V/V）無菌甘油管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 放線菌基因組提取采用Chelex-100法（周雙清等，2010）通過梯度PCR擴增得到16S rRNA基因序列（Walsh et al.，1991），利用瓊脂糖凝膠電泳初步評價目的條帶大小及擴增質(zhì)量，切膠回收目的條帶并委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進行測序分析。

測序結(jié)果利用DNA Star軟件處理，所得到16S rRNA基因序列通過數(shù)據(jù)庫EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）（Yoon et al.，2017）進行相似性搜索和在線比對，獲得相似性最高且有效發(fā)表的典型菌株，并以此作為參比對象。

1.3 紅樹根系土壤放線菌活性實驗

1.3.1 紅樹根系土壤放線菌粗提物的制備 參考覃媚等（2016）的方法，將根系放線菌于改良ISP2固體培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)，在其對數(shù)生長期接種到4瓶200 mL改良ISP2液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r·min1搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取三次，萃取液減壓濃縮置于干燥器中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紅樹根系土壤放線菌抗衰老活性測試方法

以秀麗隱桿線蟲為模型對紅樹林根系土壤放線菌發(fā)酵產(chǎn)物進行活性篩選，記錄線蟲的壽命數(shù)據(jù)（Lakowski & Hekimi，1998），所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0進行統(tǒng)計分析，并用Excel 2013軟件做表、繪圖，評價放線菌發(fā)酵產(chǎn)物延緩衰老的生物活性。

用 M9緩沖液將蟲體洗凈，離心棄去上清液;以1∶3的比例將裂解液（1 mL 5 mol·L1的NaOH和0.5 mL 5%的 NaClO混勻使用）加入蟲體中，震蕩離心后。分別將20 μL大腸桿菌發(fā)酵液、30 μL線蟲pellet、150 μL M9 Buffer加入96孔板的各個孔中，設(shè)置陰性對照。置于20 ℃ 生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后可得L4期線蟲。

粗提物樣品用1%的DMSO溶液超聲溶解成濃度為500 μg·mL1藥液，將培養(yǎng)好的L4期線蟲挑至加有50 μL藥液的NGM培養(yǎng)基（Brenner，1974），置于20 ℃ 生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組2個平板，每個平板20條L4期線蟲，此時培養(yǎng)天數(shù)記為0 d。此后，隔天對培養(yǎng)的線蟲進行計數(shù)，觀察并記錄線蟲生存、死亡及剔除的數(shù)量，將線蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，直至線蟲全部死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹植物根系放線菌多樣性分析

根據(jù)菌落形態(tài)特征及16S rRNA基因序列分析結(jié)果，本研究從7份紅樹林根系土壤中共分離鑒定得到22株放線菌，由9個屬組成，隸屬于4目7科，鏈霉菌屬（Streptomyces）分離出11株菌為優(yōu)勢菌群，詳細物種信息如表2所示。菌株IMDGX 6012、IMDGX 6028、IMDGX 6118、 IMDGX 6326、IMDGX 6119分別與有效發(fā)表菌株Amycolatopsis lexingtonensis、A. niigatensis、Curtobacterium albidum、C. citreum、Demequina salsinemoris的最高相似率為97.75%、98.15%、98.32%、98.44%、98.45%。根據(jù)放線菌16S rRNA基因序列相似性小于98.65%的菌株屬于潛在新物種的歸類原則（Kim et al，2014），以上五株根系放線菌可能為潛在的新物種。IMDGX 6119分離于白骨壤根系土壤（2-2），其余四株潛在新菌株均來自于紅海欖根系土壤（1-14）。

2.2 22株放線菌在不同紅樹土壤樣品、培養(yǎng)基中的分布

22株根系細菌在7份不同植物根系土壤樣品分布情況如圖1。從1-14土壤樣品分離獲得10株菌株隸屬于4個屬，包括擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、Sinomona、鏈霉菌屬（Streptomyces），分離菌株數(shù)量最多且菌屬最為豐富。其次是從2-2土壤樣品分離得到4株菌株隸屬于3個屬，包括Demequina、Lysinimicrobium和鏈霉菌屬（Streptomyces）。而2-1土壤樣品未分離得到放線菌。

7種分離培養(yǎng)基對紅樹根系土壤放線菌分離效果見圖2。研究結(jié)果表明M11和P3培養(yǎng)基更適合于海洋放線菌分選，其中從M11培養(yǎng)基共分離獲得1株Lysinimicrobium、2株Amycolatopsis、5株Streptomyces和1株Sinomonas。從P3培養(yǎng)基共分離獲得1株Amycolatopsis、1株Curtobacterium、1株Microbacterium、1株Demequina和4株Streptomyces。其中Amycolatopsis、Lysinimicrobium、Amycolatopsis、Curtobacterium、Microbacterium和Demequina均為稀有放線菌屬。因此無論從分選獲得的菌株數(shù)量或多樣性而言，M11和P3兩種培養(yǎng)基在分離紅樹根系放線菌方面均具有較明顯的優(yōu)勢。此外，擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）在M5、P3、M9、M11培養(yǎng)基上都能生長，P7、P3、M7培養(yǎng)基均能分離得到短小桿菌（Curtobacterium）。

2.3 紅樹植物根系放線菌發(fā)酵產(chǎn)物活性分析

秀麗隱桿線蟲具有遺傳背景清晰、生命周期短、同期化后個體差異小、易于培養(yǎng)和觀察等特點，可進行大規(guī)模篩選，且與人類基因存在60%～80%的同源性，是壽命實驗的優(yōu)質(zhì)模型生物（Takuma，2016;Park et al.，2017）。本實驗以秀麗隱桿線蟲為模型，對分離獲得的22株放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物進行延緩衰老活性分析。

以放線菌發(fā)酵粗提物處理L4期線蟲，分析各菌株發(fā)酵粗提物對線蟲生存壽命的影響（表 3）。研究結(jié)果顯示，本研究分離得到的22株放線菌中有8株具有延緩衰老活性，其中IMDGX 6017、IMDGX 6086、IMDGX 6014、IMDGX 6093、IMDGX 6013 和IMDGX 6182 這6株紅樹根系放線菌均能顯著延緩線蟲衰老，而且以鏈霉菌屬表現(xiàn)最為突出，共有活性菌株5株，提示鏈霉菌具有產(chǎn)生延緩衰老活性物質(zhì)的極大潛力。IMDGX 6028和IMDGX 6118均來源于紅海欖土壤，作為擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）和短小桿菌屬（Curtobacterium）的潛在新物種對線蟲壽命延長作用最為顯著，均可延長L4期線蟲20%以上的壽命。

3 討論與結(jié)論

隨著陸地資源的大量開發(fā)，使得從其中發(fā)現(xiàn)新的菌種尤其是具有獨特生物活性的菌種越來越困難，未充分開發(fā)的海洋生境是豐富和新的放線菌來源（Manivasagana et al.，2014）。紅樹林獨特的生態(tài)系統(tǒng)決定微生物必須從遺傳水平上進行調(diào)整，使其適應(yīng)周圍苛刻的生長環(huán)境。海洋微生物適應(yīng)其周圍苛刻環(huán)境的機制之一是激活部分沉默基因，合成具有特殊生物活性的次生代謝產(chǎn)物，從而保證細胞在高鹽、低溫等環(huán)境中正常的生理活性（Wilson & Brimble，2009）。因此，鑒于特殊的生態(tài)系統(tǒng)，紅樹林也是新型生物活性代謝物的主產(chǎn)區(qū)（Jiang et al.，2015）。自2007年以來，已從紅樹林環(huán)境中分離和鑒定了8個新屬66個新種，發(fā)現(xiàn)了大量由放線菌產(chǎn)生的新的生物活性化合物（Jiang et al.，2018）。

20世紀以來已有大量新型化合物被發(fā)現(xiàn)，大量已知化合物的干擾使得此后新化合物的發(fā)現(xiàn)概率大大降低（Subramani & Aalbersberg，2013）。為了獲得新的活性代謝物，針對特定生境的微生物多樣性進行研究是必要的，而對于稀有微生物理應(yīng)獲得更多重視（Tiwari & Gupta，2012）。Subramani &Aalbersberg（2013）同樣提出新的放線菌種屬和稀有放線菌應(yīng)成為挖掘新型化合物的研究重點。而稀有放線菌不僅包括自然界稀有的放線菌，也包括不易被培養(yǎng)的放線菌（Stach，2010）。因此，選擇合適的分離介質(zhì)就顯得極為關(guān)鍵。本研究通過不同土壤樣品和不同培養(yǎng)條件對海南西海岸紅樹林采集根系土壤開展放線菌多樣性研究，共分離得到22株放線菌，其中11株為稀有菌株，覆蓋8屬，其中5株潛在新物種均屬于稀有放線菌，包括2株擬無枝酸桿菌屬、2株短小桿菌屬和1株Demequina。據(jù)報道，擬無枝酸桿菌屬含有20多個次級代謝基因簇，這些基因簇可在不同的環(huán)境條件下被激活，合成特定的次生代謝產(chǎn)物從而使細胞表現(xiàn)出多種生物活性，如免疫抑制、抗癌等（Peano et al.，2014;Kumari et al.，2016）。本研究中發(fā)現(xiàn)的部分放線菌株的發(fā)酵粗提物能夠顯著延長線蟲壽命，尤其兩株新型稀有放線菌，當其代謝粗產(chǎn)物濃度為500 μg·mL1時可使線蟲壽命延長20%。通過本次研究，進一步說明了新型菌株尤其是稀有菌株在挖掘新化合物領(lǐng)域的重要性。前期文獻報道放線菌的次生代謝物的生物活性主要集中在抑菌、抗癌、大分子抑制劑等，而對于延緩衰老活性則鮮有報道，說明這些菌株的代謝產(chǎn)物中可能包含了新化合物，從而賦予菌株延緩衰老活性。但是對于菌株能夠延緩秀麗隱桿線蟲衰老的有效物質(zhì)和機制仍不清楚，需要我們在今后的工作中進一步開展大量工作進行驗證，包括單體的分離鑒定、單體的生物活性分析、開展秀麗隱桿線蟲組學(xué)研究等等。

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（責(zé)任編輯 李 莉）