國家標準GB/T 21316—2007測定動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的不確定度評定

陳章捷

摘要? ? 對國家標準GB/T 21316—2007測定動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測量不確定度進行評定。根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）和《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）中的規(guī)定，建立測定鰻魚肉中磺胺殘留量測定的數(shù)學模型，根據(jù)測量不確定度的來源，以磺胺甲基嘧啶為例，對各個不確定度分量進行評定和分析。評定結(jié)果表明，當樣品磺胺甲基嘧啶含量檢測結(jié)果為10.4 μg/kg時，擴展不確定度為3.4 μg/kg。不確定度按照從大到小排列，依次為標準曲線最小二乘法擬合、測量重復性、回收率、標準溶液制備、LC/MS/MS定量重復性、樣品定容、樣品稱量。

關(guān)鍵詞? ? 國家標準;GB/T 21316—2007;動物源性食品;磺胺;不確定度評定

中圖分類號? ? S859.84? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

Abstract? ? The uncertainty of determination of sulfonamide residues in animal-derived foods by GB/T 21316-2007 was evaluated.According to "Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement"（JJF 1059.1-2012）and "Guidance on Quantifying Uncertainty in Chemical Analysis"（CNAS-GL006：2019），a mathematical model for determination of sulfonamide residues in eel meat was established.Based on the sources of the measurement uncertainty，each uncertainty of sulfamethazine as an example was evaluated and analyzed.The evaluation results showed that the extended uncertainty was 3.4 μg/kg when the test result of sulfamethazine content in samples was 10.4 μg/kg.The uncertainty was arranged in order from large to small，which were least squares calibration，measurement repeatability，recovery rate，standard solution preparation，LC/MS/MS quantitative repeatability，sample volume determination and sample weighing.

Key words? ? national standard;GB/T 21316-2007;animal-derived food;sulfonamide;uncertainty evaluation

磺胺類藥物是以對位氨基苯磺酰胺（簡稱磺胺）為基本結(jié)構(gòu)的一類人工合成抗生素的總稱，具有抗菌譜廣、吸收迅速、使用方便、價格低廉等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學和畜牧行業(yè)。然而，磺胺類藥物在動物體中使用也會產(chǎn)生藥物殘留風險。這類藥物會造成排尿、造血紊亂等副作用和過敏反應(yīng)，人類若大量攝入將對健康造成危害[1-7]。我國農(nóng)業(yè)部235號公告明確規(guī)定，在動物肌肉、脂肪、肝、腎及牛羊奶中，磺胺類藥物殘留總量不得超過100 μg/kg。國際食品法典委員會、美國、日本、歐盟均對食品中磺胺類藥物規(guī)定了最高殘留限量[1-3，6-7]。

《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（GB/T 21316—2007）[8]是國家食品安全監(jiān)督抽檢指定的動物源性食品中磺胺類藥物檢測國家標準。由于監(jiān)督抽檢結(jié)果關(guān)乎被抽檢的食品生產(chǎn)經(jīng)營者切身利益，需要對檢測結(jié)果的不確定度開展評定，以評價抽檢結(jié)果的準確度。采用該國家標準對市售鰻魚樣品進行磺胺殘留量測定，然后依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]的基本要求，并參考《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）[10]（該指南等同采用EURACHEM發(fā)布的《Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement》[11]）的評估方法，對檢測過程進行了不確定度評定，以期為食品監(jiān)督抽檢機構(gòu)和檢測人員在檢測磺胺類藥物殘留過程中提供技術(shù)參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 主要儀器與試劑

XEVO TQ-S超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）;XSE204電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團）;Milli-Q IQ 7000超純水機（美國默克集團）;移液器（20～200、100～1 000 μL，美國艾本德公司;CR22N高速冷凍離心機（日本日立集團）;RE80旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本雅馬拓科學公司）;KQ-1500DE超聲波清洗儀（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

100 μg/mL磺胺類標準物質(zhì)（GB/T 21316規(guī)定的23種，德國Pharma公司）;乙腈、正己烷、正丙醇、甲酸（均為色譜純，賽默飛世爾科技公司）。

1.2? ? 樣品處理

將鰻魚制成糜樣，稱取2 g置于50 mL離心管，加入6 g C18填料，使樣品與填料混合均勻，加入25 mL乙腈-水（1 000∶30）溶液旋渦振蕩1 min，微波爐光波模式下輻照30 s，3 000 r/min離心5 min，將乙腈層移入100 mL棕色分液漏斗，離心后的沉淀物加25 mL乙腈提取30 s，3 000 r/min離心5 min，合并乙腈提取液。在提取液中加入25 mL乙腈飽和正己烷，振搖5 min，將底層乙腈移入150 mL雞心瓶中，加入10 mL正丙醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃減壓蒸發(fā)近干，氮氣流吹干。加入1 mL乙腈水溶液（1∶1），超聲30 s溶解殘渣，將溶解液移入10 mL離心管，加0.5 mL乙腈飽和正己烷，振蕩2 min，3 000 r/min離心5min，棄去正己烷，取底層乙腈水溶液過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.3? ? 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC@BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;流動相：A相為乙腈，B相為0.1%甲酸。梯度洗脫程序為0～0.2 min，2%A;0.2～3.0 min，2%A加至30%A;3.0～4.0 min，30%A加至70% A;4.0～6.0 min，70%A加至95%A;6.0～6.1 min，95%A減至2%A;6.1～7.0 min，2%A;柱溫25 ℃;進樣量1 μL;流速0.2 mL/min。

1.4? ? 質(zhì)譜條件

電離模式為ESI+;監(jiān)測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;電噴霧電壓5 500 V;霧化氣壓力0.065 MPa;氣簾氣壓力0.016 MPa;輔助氣壓力0.060 MPa;離子源溫度475 ℃。定性離子對、定量離子對、碰撞電壓和去簇電壓參照GB/T 21316—2007中質(zhì)譜測定參考條件設(shè)置。

1.5? ? 測定

用空白基質(zhì)配備標準溶液系列，濃度為20、40、60、80、100 ng/mL。按照1.2～1.4方法對鰻魚樣品進行測定。

1.6? ? 計算公式和數(shù)學模型

樣品中磺胺含量按公式計算：

式中：x為樣品中磺胺藥物含量單位為μg/kg;c為從標準工作曲線得到的磺胺類藥物的濃度，單位為ng/mL;V為定容體積，單位為mL;m為樣品質(zhì)量，單位為g。

上述計算公式是從測量原理給出的，未考慮各種隨機因素對不確定度的影響，在此引入反映隨機影響的重復性系數(shù)frep。另外，由于樣品前處理過程較為復雜，通過同時測定加標回收率，引入回收率值R用于校正結(jié)果。評定不確定度的數(shù)學模型應(yīng)寫成如下形式：

1.7? ? 識別和分析不確定度來源

通過繪制因果圖來分析農(nóng)藥定量過程中的不確定度來源[12-15]，見圖1。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不確定度分量的計算（以磺胺甲基嘧啶為例）

2.2? ? 標準溶液制備引入的不確定度

2.2.1? ? 標準品純度引入的不確定度。磺胺甲基嘧啶標準物質(zhì)證書中說明其定值為100 μg/mL±3%，則相對擴展不確定度為3%，按正態(tài)分布計算，k=2，相對標準不確定度為urel（p）=0.03/2=0.015。

2.2.2? ? 標準中間溶液配制引入的不確定度。用20～200 μL移液器移取標準物質(zhì)100 μL至10 mL容量瓶，配制1 μg/mL標準中間液。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006），200 μL可調(diào)移液器吸取100 μL時容量允許誤差為 ±2.0%，按均勻分布，100 μL移液器移取體積誤差引入的相對標準不確定度urel（100 μL）=0.012。根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），A級單標線10 mL容量瓶允差為±0.020 mL，按三角分布計算，包含因子為6，則10 mL容量瓶稱量體積誤差引入的相對標準不確定度為urel（10 mL）=0.000 82。

2.2.3? ? 系列標準工作液配制引入的不確定度。用100～1 000 μL移液器吸取200、400、600、800、1 000 μL的1 μg/mL標準中間液于10 mL容量瓶，用空白基質(zhì)配制成系列標準溶液。查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006），1 000 μL可調(diào)移液器移取100 μL時，允差為2.0%，移取500 μL允差為1.0%，移取1 000 μL允差為1.0%。實際移取200、400 μL時允差以2.0%計算，600、800、1 000 μL時允差以1.0%計算。按均勻分布，則urel（200 μL）=0.012，urel（400 μL）=0.012，urel（600 μL）=0.005 8，urel（800 μL）=0.005 8，urel（1 000 μL）=0.005 8。10 mL容量瓶稱量體積誤差引入的相對標準不確定度urel（10 mL）=0.000 82。

2.2.4? ? 實際操作溫度與校正溫度不同引入的不確定度。配制過程因與校正溫度不同引入的相對不確定度按下式計算：

其中，α為液體的體積膨脹系數(shù)，ΔT為溫差。

吸取基質(zhì)為甲醇的母液1次，用乙腈定容1次，吸取基質(zhì)為乙腈的中間液5次，用空白基質(zhì)（主要為1∶1乙腈水溶液）定容5次。α甲醇=0.001 18/℃，α乙腈=0.001 37/℃，α水=0.000 208/℃。α乙腈水溶液=0.5α水+0.5α乙腈=0.000 789/℃，ΔT=±3 ℃。urel（T甲醇）=0.002 04，urel（T乙腈）=0.002 37，urel（T乙腈水溶液）=0.001 37。因此，urel（Ts）=0.006 67。

2.2.5? ? 合成標準溶液制備引入的不確定度。

2.3? ? 樣品定容引入的不確定度

用100～1 000 μL移液器吸取1 mL乙腈水溶液溶解殘渣，移液器允差為1.0%，按均勻分布，則相對標準不確定度urel（Vm）=0.005 8。移液器移取時的溫度與校正溫度的差異引入的相對標準不確定度urel（T）=0.001 37。因此，樣品定容步驟引入的不確定度為urel（V）=0.006 0。

2.4? ? LC/MS/MS 儀器測定帶來的不確定度

計量證書上定量重復性為1%，按均勻分布，儀器定量重復性引入的相對標準不確定度urel（LCMSMS）=0.007 1。

2.5? ? 最小二乘法擬合引入的不確定度

采用空白基質(zhì)配制5種濃度標液，每個濃度點測定1次，測定數(shù)據(jù)見表1。通過線性擬合得回歸方程y=20 757.730 15x-5.922 04×104，相關(guān)系數(shù)為0.997 87，方程顯著有效（α=5%）。

回歸直線的標準偏差按下式計算：

其中，yij為儀器各點響應(yīng)值;n為測量點數(shù)目;m為每個測量點重復測定次數(shù);為回歸直線計算的峰面積值。n=5，m=1，計算Sy/x=44 713。

擬合帶來的不確定度用下式計算：

其中，B為回歸曲線斜率，P為測試樣品次數(shù)，n為測定標準溶液的次數(shù)（總次數(shù)），x為未知樣的進樣濃度，xi為標準曲線每一點的濃度值，x為標準曲線濃度的平均值。計算得u（c）=2.7。

對鰻魚樣品進行一次測定，通過回歸曲線計算樣品最后進樣濃度為20.7 μg/mL，故最小二乘法擬合引入的相對標準不確定度為urel（c）=2.7/20.7=0.13。

2.6? ? 測量重復性帶來的不確定度（A類評定）

考慮到同一檢測人員在固定的操作環(huán)境下嚴格按照國標方法對樣品開展測定，測量系統(tǒng)穩(wěn)定，根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），可通過對樣品進行10次獨立測定，預先評估單個測定值的試驗標準偏差。

10次測定結(jié)果依次為x1=10.3 μg/kg、x2=11.5 μg/kg、x3=10.5 μg/kg、x4=9.72 μg/kg、x5=9.91 μg/kg、x6=11.6 μg/kg、x7=10.8 μg/kg、x8=9.93 μg/kg、x9=9.79 μg/kg、x10=11.6 μg/kg，平均值x=10.6 μg/kg，測量次數(shù)n=10。單次測量的試驗標準偏差S（xk）=0.767。

實際測定時只測定1次，n′=1，測定值為10.4 μg/kg，故單次測量值的A類相對不確定度為：

2.7? ? 回收率帶來的不確定度

用空白鰻魚樣品以10 μg/kg濃度進行6次加標回收測試，回收率結(jié)果見表2。

經(jīng)計算，平均回收率（R）為89.5%，標準偏差S（R）為0.087 5，平均回收率的相對標準不確定度u（R）=0.035 7。根據(jù)《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）中偏倚研究的方法，可用t檢驗來確定平均回收率R是否與100%有顯著性差異：檢驗統(tǒng)計量t=2.93;而95%置信度，n-1自由度下的雙側(cè)臨界值t（0.05，5）=2.571，t>t（0.05，5），故R與100%有顯著性差異，需要進行回收率校正。回收率校正帶入的相對標準不確定度urel（R）=0.040。

2.8? ? 合成標準不確定度

試樣中磺胺甲基嘧啶含量x的合成標準不確定度計算如下：

3? ? 結(jié)論與討論

依據(jù)國家標準GB/T 21316—2007對鰻魚肉中磺胺類藥物殘留量進行測定，并以磺胺甲基嘧啶為例，給出了檢測結(jié)果的不確定度評定示范，為相關(guān)食品安全監(jiān)督抽檢報告的結(jié)果提供了可靠性評估依據(jù)。另外，通過比較不確定度各個分量的值，發(fā)現(xiàn)檢測過程各個環(huán)節(jié)對檢測結(jié)果的不確定度影響程度不同;影響最大的是標準曲線最小二乘法擬合和測量重復性，其余因素按照從大到小依次為回收率、標準溶液制備、LC/MS/MS定量重復性、樣品定容、樣品稱量。因此，檢測人員按該標準進行檢測時，可通過增加標準曲線每個濃度點的測定次數(shù)、增加標準溶液系列點數(shù)和增加實際樣品平行測定次數(shù)等手段，減少標準曲線線性擬合和測量重復性所引入的不確定度，從而減少最終檢測結(jié)果的不確定度，提高檢測結(jié)果的可靠性。

4? ? 參考文獻

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