SIX1 和TGF-β對原代人喉鱗癌細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

張繼華，董凱峰，蘇靜，李丹，田君海

大量實驗顯示，上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在誘導惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移過程中起著不可替代的作用。這一過程是由多個信號傳導途徑觸發(fā)和調(diào)控的，這些信號途徑能夠?qū)毎獾拇碳ぎa(chǎn)生應答而激活。在這些傳導途徑中，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)途徑被認為是最重要的途徑之一[1-2]。以往研究表明，SIX1同TGF-β相互作用能夠促進多種惡性腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3]，推測SIX1及TGF-β在喉鱗癌細胞中表達的變化，會進一步影響腫瘤細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，進而影響喉癌的轉(zhuǎn)移，但它們之間的相互作用機制及對喉癌細胞EMT的影響尚未見報道。本研究通過原代細胞培養(yǎng)，對喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及上皮標志物E-cadherin的mRNA及蛋白表達進行了檢測， 旨在探討人喉鱗癌細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中SIX1 和TGF-β的相互作用及機制，為臨床診治提供理論依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)試劑試藥：SIX1免疫組化用多克隆抗體(工作濃度為1∶75)、TGF-β免疫組化用多克隆抗體(工作濃度為1∶55)由武漢博士德公司提供， E-cadherin免疫組化用多克隆抗體(工作濃度為1∶50)由北京奧維亞生物技術(shù)有限公司提供，免疫組化用S-P染色試劑盒、DAB顯色用試劑由北京中杉金橋公司提供。轉(zhuǎn)染用SIX1和TGF-β試劑盒由美國Invitrogen公司提供。胎牛血清(購自杭州四季青生物材料研究所)置于-20℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?胰蛋白酶(購自GIBCO公司，北京邦定生物醫(yī)學公司分裝)。用D-hank’s液配成0.25%溶液，無菌條件下濾過孔徑 0.22 μm的混合纖維素微孔濾膜，無菌分裝后，-20℃冰箱低溫保存?zhèn)溆?。硫酸慶大霉素注射液(輔仁藥業(yè)有限公司)。 (2)儀器設(shè)備： MCO175型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋產(chǎn)品)。CX-PC-2型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng):收集2016年1月—2018年1月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉科行喉鱗狀細胞癌手術(shù)患者21例，均留存切除組織，置于4℃的0.9%氯化鈉注射液中無菌保存。部分組織塊盡快轉(zhuǎn)移至實驗室超凈臺，進行處理并原代細胞培養(yǎng)，修剪留取新鮮、正常腫瘤組織，慶大霉素殺菌處理15 min，0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，將組織塊剪碎(初步使組織塊分離成單細胞)，慶大霉素液沖洗2次，0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，加入Ⅰ型膠原酶消化1 h，每間隔10 min進行一次吹打混合，促進喉癌組織塊分解成單個腫瘤細胞。消化結(jié)束后，生理鹽水沖洗細胞混合液2次，加入細胞培養(yǎng)液，內(nèi)含20%胎牛血清，將細胞懸濁液接種于6孔滅菌細胞培養(yǎng)板，上述接種的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，培養(yǎng)孔內(nèi)加入消化用胰蛋白酶，利用雜質(zhì)細胞(成纖維細胞為主)與喉鱗癌腫瘤細胞對胰蛋白酶消化作用不同，而出現(xiàn)不同細胞脫離培養(yǎng)板底壁時間差異，去除雜質(zhì)細胞。反復進行上述純化，直至得到純化的腫瘤細胞。待其穩(wěn)定傳代后，對培養(yǎng)細胞進行鑒定并確認為鱗狀細胞癌細胞(由2名高年資病理科醫(yī)生共同鑒定)，擴增細胞，進行試驗。

1.2.2 原代細胞轉(zhuǎn)染及分組: 待細胞生化穩(wěn)定后，制作SIX1 siRNA、TGF-β siRNA和SIX1+TGF-β siRNA，siRNA轉(zhuǎn)染至原代人喉癌細胞，沉默細胞內(nèi)的SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β基因表達。具體步驟如下，接種原代人喉鱗癌細胞至6孔細胞培養(yǎng)板，每孔腫瘤細胞量約為3×105個，每孔內(nèi)加入細胞培養(yǎng)液約2 ml，放于培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)過夜。觀察細胞生長狀態(tài)，單層細胞量約60%匯合時進行試驗。A溶液配制(用于轉(zhuǎn)染的純DNA 2 μg加入不含血清培養(yǎng)液中，最終體積約100 μl)，B溶液(LipofectAMINE 100 μl，加入不含血清培養(yǎng)液中，最終體積120 μl)，混合A和B 2種溶液，輕搖勻，室溫下放置30 min。用細胞培養(yǎng)液2 ml輕洗滌腫瘤細胞，培養(yǎng)孔內(nèi)加入細胞培養(yǎng)液(不含血清)0.8 ml，加入上述復合物，輕輕搖動混勻混合液，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)箱，常規(guī)孵育24 h。用完全細胞培養(yǎng)基替換孔內(nèi)轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h， PCR法對SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β表達檢測，檢測確定轉(zhuǎn)染成功后分組：未轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)組、SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 免疫細胞化學法檢測SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達：消化原代人喉鱗狀細胞癌細胞，用細胞培養(yǎng)液配制細胞懸液，使其濃度為1×105個/ml， 取24孔細胞培養(yǎng)板，板內(nèi)置已滅菌玻璃片，每組設(shè)6孔，向孔內(nèi)滅菌玻璃片上接種腫瘤細胞，每孔接種上述細胞懸液1滴。細胞移至細胞培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，待玻璃片上>80%細胞已經(jīng)貼壁，向培養(yǎng)板內(nèi)加DMEM培養(yǎng)液每孔約1 ml。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)板內(nèi)腫瘤細胞已達80%～90%匯合，取出培養(yǎng)板，PBS溶液沖洗1次，甲醛溶液固定10 min，PBS溶液沖洗2次，每次5 min。留取玻璃片上爬片細胞，參照免疫組化試劑說明，進行爬片細胞免疫熒光染色，蓋玻片封存，鏡檢。

結(jié)果判斷。采用半定量雙評分法，倒置熒光顯微鏡高倍鏡視野下根據(jù)陽性細胞所占比例及細胞綠色熒光強度做綜合判定。高倍鏡下視野內(nèi)陽性細胞比例：陽性細胞比例<25%，記0 分；陽性細胞比例25%～50%，記1 分；陽性細胞比例51%～75%，記2 分；陽性細胞比例>75%，記3分。表達強度評分標準，未見熒光或僅見極弱熒光， 記0 分；熒光微弱但明顯可見，記1 分；熒光可見且光色明亮，記2 分；熒光可見且光色閃亮， 記3 分。2種方法所得評分相加為總分，得分0～1分為目的蛋白陰性(-)； 2分為目的蛋白弱陽性(+)； 3～4分為目的蛋白陽性(++)， 5～6分為目的蛋白強陽性(+++)。

1.3.2 Western-blot法檢測腫瘤細胞內(nèi)SIX1、TGF-β、E-cadherin蛋白表達：參照試劑說明書，提取樣本蛋白，制備Western-blot檢測樣品，檢測各組樣品蛋白濃度，常規(guī)上樣，配制選用12%分離膠及4%濃縮膠，每組樣品上樣量65 μg，同時設(shè)置Marker預染蛋白，100 V電泳約85 min，轉(zhuǎn)膜30 V，0.9 mA過夜。洗膜，定影后進行圖像分析。

1.3.3 RT-PCR法測定各組腫瘤細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA：Trizol法提取樣本腫瘤細胞總RNA，檢測各組樣本細胞濃度，確定樣本細胞RNA完整，cDNA反轉(zhuǎn)錄合成，取轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl進行PCR反應。GAPDH引物序列上游 5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3' ,下游 5'-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3';SIX1引物序列上游5′-CCACTAGAAGAGGAATT-3′，下游5′-CACGCCGGAGCCAAACT-3′，產(chǎn)物大小254 bp，退火溫度56.3℃； TGF-β引物序列上游 5′- CTGTAATTCTGCTGTAATA-3′，下游 5′-GGCTTAGTATTCTGGGAAA-3′，產(chǎn)物大小287 bp，退火溫度54.2℃；E-cadherin引物序列上游5'-AGGCCAAGCAGCAGTACATT-3' ，下游5'-ATTCACATCCAGCACATCCA-3，產(chǎn)物大小為288 bp，退火溫度為56.6℃。反應條件如下，94℃變性1 min，57℃復性1 min，75℃延伸1 min，共設(shè)計32個循環(huán)，最后設(shè)計75℃延伸10 min。以GAPDH的熒光表達量度作為檢測基因表達參照量。

2 結(jié) 果

2.1 免疫細胞化學法檢測各組人喉鱗癌細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達比較 與未轉(zhuǎn)染組比較，空轉(zhuǎn)組細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白表達明顯下調(diào)，TGF-β蛋白表達無明顯差異；TGF-β轉(zhuǎn)染組TGF-β蛋白表達明顯下調(diào)，SIX1蛋白表達無明顯差異；SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白及TGF-β蛋白表達均明顯下調(diào)(P<0.01)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組E-cadherin 蛋白表達均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(F/P=6.846/0.006)。TGF-β轉(zhuǎn)染組、SIX1轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組比較，E-cadherin蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1、表1。

表1 免疫細胞化學法檢測各組細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達水平比較分)

圖1 各組喉鱗癌細胞中E-cadherin表達情況(免疫熒光染色，×100)

2.2 Western-blot法檢測各組人喉鱗癌細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達比較 與未轉(zhuǎn)染組比較，空轉(zhuǎn)組細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白表達明顯下調(diào)，TGF-β蛋白表達無明顯差異；TGF-β轉(zhuǎn)染組TGF-β蛋白表達明顯下調(diào)，SIX1蛋白表達無明顯差異；SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組SIX1蛋白及TGF-β蛋白表達均明顯下調(diào)(P<0.01)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組E-cadherin 蛋白表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(F/P=13.396/0.000)，TGF-β轉(zhuǎn)染組、SIX1轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組比較，E-cadherin蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 RT-PCR法測定各組人喉鱗癌細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達水平比較 與未轉(zhuǎn)染組比較，空轉(zhuǎn)組細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組SIX1 mRNA表達明顯下調(diào)，TGF-β mRNA表達無明顯差異；TGF-β轉(zhuǎn)染組TGF-β mRNA表達明顯下調(diào)，SIX1 mRNA表達無明顯差異；SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組SIX1 mRNA及TGF-β mRNA表達均明顯下調(diào)(P<0.01)。與未轉(zhuǎn)染組比較，SIX1轉(zhuǎn)染組、TGF-β轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組E-cadherin mRNA表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(F/P=9.673/0.000)，TGF-β轉(zhuǎn)染組、SIX1轉(zhuǎn)染組及SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組比較，E-cadherin mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、表3。

注： A.空轉(zhuǎn)組；B.未轉(zhuǎn)染組；C.SIX1轉(zhuǎn)染組；D.TGF-β轉(zhuǎn)染組； E.SIX1+TGF-β轉(zhuǎn)染組

圖2 E-cadherin mRNA 在各組人喉鱗癌細胞中的表達情況

3 討 論

上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指腫瘤上皮細胞在一定的環(huán)境及相應轉(zhuǎn)化因子等因素共同影響下逐步轉(zhuǎn)變成充質(zhì)細胞的現(xiàn)象。目前多數(shù)學者認為，EMT是惡性腫瘤生長、轉(zhuǎn)變的過程之一，與惡性腫瘤細胞的局部浸潤及遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。EMT轉(zhuǎn)化的過程主要表現(xiàn)為原腫瘤上皮細胞極性逐漸消失，上皮細胞與周圍其他細胞的接觸相應減少，細胞間的連接包括黏附連接及緊密連接減少，使得細胞脫離的機會增加，易于發(fā)生局部浸潤及遠處遷移；EMT的發(fā)生會出現(xiàn)原有上皮細胞表型的轉(zhuǎn)變，其上皮表型如E- eadherin、角蛋白絲等消失，間質(zhì)表型纖維連接蛋白、N-鈣黏素等逐漸形成。其中代表細胞間黏附力的E-cadherin表達下降是EMT的主要表現(xiàn)，也被視為EMT轉(zhuǎn)化的標志[4]。實驗研究表明，EMT與腫瘤細胞向局部浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移的過程密切相關(guān)，EMT可誘導多種惡性腫瘤細胞局部浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移，如卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌及惡性黑色素瘤等[5-8]。因此，EMT被認為是多種上皮來源腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標志。

表2 Western-blot法檢測各組細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達水平比較

表3 RT-PCR法檢測各組細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達水平比較

上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程是由多個信號傳導通路觸發(fā)和調(diào)控的，在這些信號傳導通路中，TGF-β被認為是最重要的途徑之一。TGF-β能夠通過MAPK (mitogen-activated protein kinases)通路、SMAD通路及Wnt通路等途徑對腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)，在大腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中均存在TGF-β的高表達，其表達強度與腫瘤的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)[9-11]。以往的研究證實，TGF-β能夠被細胞中的多種活性因子激活，并與這些因子共同作用，激活及影響細胞內(nèi)多種傳導通路，但腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄因子的高表達能否增強TGF-β途徑在誘導人喉鱗癌EMT過程中的作用尚不清楚。

SIX1(sine oculis homeobox homolog 1)是一種與細胞成熟相關(guān)的細胞因子，在發(fā)育成熟的細胞內(nèi)很少表達，然而最近研究表明，SIX1在多種惡性腫瘤組織中卻呈現(xiàn)出高表達，SIX1能夠影響Cyclin A1、Cyclin D1及Ezrin 等多種下游編碼基因的表達。SIX1在卵巢癌、乳腺癌、肝細胞癌等多種惡性腫瘤中表達強度與腫瘤的預后密切相關(guān)[12-14]。最近研究證明，SIX1 能夠與TGF-β共同作用，并通過SMAD2/3途徑調(diào)節(jié)VEGF等多種基因的表達，進而發(fā)揮其促進腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移功能，基于以上研究結(jié)果，本研究探討SIX1與TGF-β是否在人喉鱗癌EMT的過程中起著促進作用。

Sun等[15]的研究結(jié)果顯示，SIX1能夠同 TGF-β共同作用促進卵巢癌細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進一步提高卵巢癌細胞局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移的能力。本結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，喉癌細胞內(nèi)SIX1表達降低的同時出現(xiàn)了E-cadherin mRNA及蛋白表達的上調(diào)，同樣，TGF-β表達降低的同時也出現(xiàn)了喉癌細胞E-cadherin mRNA及蛋白表達的上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明SIX1及TGF-β均參與了人喉鱗癌細胞EMT的過程，SIX1和/或TGF-β表達降低均能抑制人喉鱗癌細胞EMT的發(fā)生。同時，本研究結(jié)果還顯示，抑制TGF-β表達、抑制SIX1表達同抑制SIX1+TGF-β表達均能導致人喉鱗癌細胞E-cadherin mRNA及其蛋白表達的上調(diào)，且3組間E-cadherin mRNA及其蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義。提示在人喉鱗癌細胞EMT的過程中TGF-β及SIX1并不能單獨發(fā)揮作用，而需要TGF-β和SIX1共同作用。SIX1和TGF-β共同誘導人喉鱗癌細胞EMT的過程是通過TGF-β及SIX1共同作用途徑實現(xiàn)的。推測SIX1在人喉鱗癌細胞中表達升高能夠增強TGF-β對腫瘤細胞的敏感性，進而通過TGF-β途徑促進喉鱗癌細胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。與此同時，TGF-β促進喉鱗癌細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程需要SIX1的存在，但其具體的作用機制尚待進一步研究。

綜上，SIX1 、TGF-β共同作用可能是人喉鱗癌細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，SIX1和TGF-β是人喉鱗癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的重要標志，有望成為臨床治療人喉鱗癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張繼華：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，論文修改；董凱峰：實施研究過程，資料搜集整理；蘇靜：進行統(tǒng)計學分析；李丹：實施研究過程，資料搜集整理，論文撰寫；田君海：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核