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      人參多糖對(duì)腦出血模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

      2020-04-20 10:18:24鄭希院翟潔敏李會(huì)琪趙龍斌高章代
      疑難病雜志 2020年4期
      關(guān)鍵詞:勻漿人參海馬

      鄭希院,翟潔敏,李會(huì)琪,趙龍斌,高章代

      腦出血是非外傷性腦組織內(nèi)血管破裂引起的出血,是一種常見疾病、多發(fā)疾病,發(fā)病率與病死率呈上升趨勢(shì),屬于急性腦血管病中的危重類型,嚴(yán)重危害人類的身體健康[1]。 患者在腦出血時(shí),不但會(huì)出現(xiàn)血腫性病變,還會(huì)繼發(fā)腦水腫、缺血、炎性反應(yīng)、血腫周圍組織能量代謝紊亂等一系列腦損傷[2]。腦出血患者發(fā)病年齡逐漸年輕化,即使幸存者亦會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙,對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響,帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。腦出血造成的腦損傷,主要由血腫擴(kuò)大導(dǎo)致的機(jī)械性壓迫所致周圍組織缺血及在血塊形成過程中和形成后導(dǎo)致[4]?,F(xiàn)觀察人參多糖對(duì)腦出血模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響,報(bào)道如下。

      1 材料與方法

      1.1 材料 (1)動(dòng)物:健康雄性SD大鼠50只,月齡6~10(8.8±0.7)月,體質(zhì)量340~480(360.0±58.6)g,由北京科奧力飼料有限公司提供[合格證號(hào):京動(dòng)(2000)第015號(hào)]。大鼠均生活于(24.0±2.1)℃的環(huán)境、無病原菌的飼養(yǎng)籠中,予高溫及高壓消毒的食物和水喂養(yǎng)。(2)試劑:人參多糖(陜西斯諾特生物科技有限公司),水合氯醛[生工生物工程(上海)股份有限公司],酶聯(lián)免疫試劑盒(北京維德維康生物技術(shù)有限公司),TBARS試劑盒(江蘇江萊生物科技有限公司)。(3)儀器:光鏡(美國(guó)Ted Pella);冰箱(Eppendorf艾本德中國(guó)有限公司,型號(hào) ep000000);電子天平(北京金達(dá)陽光科技有限公司,型號(hào) CP153);恒溫干燥箱(東菀市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司,型號(hào) SPCC);SuperMaze Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置(上海欣軟信息科技有限公司,型號(hào) XR-XM101);BD FAC SCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(北京德利卡生物科技有限公司,型號(hào) DLK0002051)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年5—7月于西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

      1.2.1 人參多糖提取物制作: 人參50 g加入蒸餾水100 ml中,冷浸過夜后,加熱煮沸30 min,留取清亮液體小火加熱濃縮到10 ml,制成含生藥2 g/ml的藥液,陰涼后以濾紙過濾藥液,再用一次性針頭濾器過濾后,分裝于安瓿滅菌后放入冰箱備用。

      1.2.2 大鼠腦出血模型建立:隨機(jī)選取大鼠10只作為正常組, 余大鼠40只使用Rosenberg法制作腦出血模型[5],以10%水合氯醛400 mg/kg于大鼠腹部注射麻醉,固定在立體儀上,在頭部正中進(jìn)行縱行切口,剝離骨膜,使冠狀縫和前囟裸露;在前囟前中線右側(cè)2.0~3.0 mm處鉆直徑>1.0 mm小孔。使用微量注射器抽取股動(dòng)脈50 μl血液,在鉆孔處垂直進(jìn)針6.0 mm左右,注入10 μl血液,2 min后以10 μl/min的速度將剩余的40 μl血液注入,留針10 min后,將針退出,并用消毒針將切口縫合,完成建模。大鼠腦橫斷面中出現(xiàn)明顯血腫,血液無針道反流情況,無蛛網(wǎng)膜下腔出血,無血腫破入腦室視為造模成功。

      1.2.3 分組及用藥:將建模成功的大鼠40只以隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組及人參多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組,各10只。人參多糖低劑量組給予2 mg/kg人參多糖,中劑量組4 mg/kg,高劑量組8 mg/kg,均灌胃3周。正常組及模型組大鼠均給予同等體積的無菌生理鹽水灌胃。治療期間所有大鼠均自由飲食。

      1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

      1.3.1 大鼠腦出血組織觀察: 大鼠在最后1次給藥后4 h進(jìn)行麻醉斷頭處理,取腦組織放置于4℃冰箱固定48 h,石蠟包埋切片、常規(guī)脫蠟、乙醇浸水,HE染色,光鏡下常規(guī)組織學(xué)檢查。

      1.3.2 腦含水量、神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分測(cè)定:(1)腦組織含水量:使用干濕質(zhì)量法檢測(cè),用精確度0.1 mg的電子天平分別測(cè)量5組大鼠的腦組織濕重,放在100℃的恒溫干燥箱烘24 h至腦組織不再減輕為止,然后測(cè)量烘培后大鼠腦組織質(zhì)量。腦組織含水量=(腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/腦組織濕重×100%。(2)神經(jīng)功能評(píng)分:使用Longa評(píng)分法[6],分為0~4級(jí)即為0~4分,無體征為0級(jí),記0分;大鼠不能完全伸直前肢為1級(jí),記1分;大鼠一側(cè)肢體癱瘓,有追尾現(xiàn)象為2級(jí),記2分;大鼠不能打滾或者站立為3級(jí),記3分;無自發(fā)性活動(dòng),有意識(shí)障礙為4級(jí),記4分。分值越高說明大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。(3)學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分:參照彭璇等[7]介紹的方法采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行動(dòng)態(tài)圖像采集,分析大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分。大鼠在Morris水迷宮中訓(xùn)練5 d后,在第6天記錄時(shí)間均值作為最終測(cè)定效果。

      1.3.3 大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率檢測(cè): 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,以37 ℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)傳代至5孔板中的細(xì)胞,加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,使用2 000 r/min的離心機(jī)處理海馬區(qū)細(xì)胞5 min后使用PBS緩沖液清洗2次,在避光常溫環(huán)境中收取離心的海馬區(qū)細(xì)胞,加入PI染液1 ml,放置1 h,然后用特異熒光標(biāo)記后,使用鞘液包裹,在高速流動(dòng)條件下,嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀操作說明檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

      涂料生產(chǎn)過程中VOCs的產(chǎn)生量取決于溶劑種類、生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)工藝等。一般而言,涂料生產(chǎn)過程中低沸點(diǎn)溶劑的用量越多,涂料生產(chǎn)過程為開放式、生產(chǎn)溫度較高、生產(chǎn)時(shí)間越長(zhǎng),并且因生產(chǎn)自動(dòng)化程度低而需要頻繁清洗設(shè)備,那么VOCs的產(chǎn)生量就越多。

      1.3.4 腦勻漿TNF-α、MDA含量檢測(cè): 取大鼠血腫周圍的新鮮腦組織200 mg加入PBS緩沖液,離心處理15 min后棄去清液,待測(cè)。使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)TNF-α濃度,嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書操作。將采集后的腦組織勻漿使用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量,嚴(yán)格按照TBARS試劑盒說明書進(jìn)行操作。

      1.3.5 大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、Akt、PI3K表達(dá)檢測(cè): 采用Western-blot法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中Bcl-2、Akt、PI3K表達(dá)量,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

      2 結(jié) 果

      2.1 5組大鼠腦出血組織觀察比較 與正常組比較,模型組出現(xiàn)腦出血組織細(xì)胞間隙增大,神經(jīng)細(xì)胞固縮,膠質(zhì)細(xì)胞增生等變化。與模型組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組腦組織的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等均減輕。與低劑量組、中劑量組比較,高劑量組腦組織排列規(guī)整,間質(zhì)水腫、膠質(zhì)細(xì)胞腫脹等明顯消退,見圖1。

      2.2 5組大鼠腦含水量、腦神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分比較 模型組大鼠腦含水量、腦神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分高于正常組(P均<0.05),低劑量組、中劑量組、高劑量組低于模型組(P均<0.05),中劑量組低于低劑量組,高劑量組低于中劑量組(P均<0.05),見表1。

      表1 5組大鼠腦含水量、腦神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分比較

      2.3 5組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較 模型組細(xì)胞凋亡率高于正常組(P均<0.05),低劑量組、中劑量組、高劑量組低于模型組(P均<0.05);中劑量組低于低劑量組,高劑量組低于中劑量組(P均<0.05),見表2。

      表2 5組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較

      圖1 5組大鼠腦出血組織形態(tài)觀察(HE染色,×400)

      表3 5組大鼠腦勻漿TNF-α、MDA含量比較

      2.5 5組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達(dá)比較 模型組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達(dá)均低于正常組(P均<0.05),低劑量組、中劑量組、高劑量組均高于模型組(P均<0.05),中劑量組高于低劑量組,高劑量組高于中劑量組(P均<0.05),見表4。

      表4 5組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達(dá)比較

      3 討 論

      腦出血屬于一種急性疾病,發(fā)病率、病死率、致殘率均較高,是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病,近年來我國(guó)腦出血的發(fā)病率逐漸升高,發(fā)病年齡也逐漸年輕化[8]。腦出血是重要的腦卒中類型,全世界范圍的發(fā)病人數(shù)每年約有200萬,腦出血占腦卒中的30%左右,病死率極高,即使幸存下來也會(huì)發(fā)生非常嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[9]。腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血,腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡在病理生理過程中極其重要[10]。

      人參在中醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用歷史悠久[11]。研究發(fā)現(xiàn),人參除了根以外,莖、葉、花及果中都含有比例各異、組分不同的生物活性分子[12]。人參中主要有人參皂甙、人參多肽、人參多糖和人參花揮發(fā)油等生物活性物質(zhì),降解分離可以獲得多種必需的氨基酸、脂肪酸及微量元素等[13]。人參多糖是最早研究的多糖類生物活性成分,主要作用是對(duì)免疫功能的影響及所產(chǎn)生的免疫性抗腫瘤活性[14],還能增加免疫力、降血糖、促進(jìn)造血、抗衰老、抗菌、抗炎等[15]。

      TNF-α可在組織損傷中增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的毒性作用,增加血管內(nèi)皮的通透性,破壞血腦屏障,使血管源性腦水腫加重。TNF-α可以趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞從而導(dǎo)致白細(xì)胞聚集阻塞微血管,導(dǎo)致繼發(fā)性缺血缺氧,從而使腦水腫和繼發(fā)性腦損傷加重[16]?;谌藚⒍嗵蔷哂锌寡?、增強(qiáng)免疫力的藥理作用,在本研究中分析人參多糖對(duì)腦出血大鼠腦勻漿TNF-α含量的影響,結(jié)果顯示,人參多糖干預(yù)后,腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量顯著降低,且劑量越高腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量越趨近于正常。此結(jié)果說明,人參多糖可通過降低腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量,來抵抗大鼠機(jī)體炎性反應(yīng),增強(qiáng)免疫力,修復(fù)大鼠腦損傷。MDA屬于自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,反映氧自由基含量的指標(biāo)[17]。腦出血患者發(fā)病后血腫周圍存在組織損傷和水腫區(qū)域,該區(qū)域內(nèi)腦組織會(huì)發(fā)生復(fù)雜的病理變化,對(duì)腦出血患者病情程度及預(yù)后造成了嚴(yán)重影響,在病理因素中,自由基的作用非常重要[18]。腦出血發(fā)生后,大鼠腦組織勻漿中MDA含量顯著增加,其增加實(shí)質(zhì)為自由基所引起的神經(jīng)細(xì)胞過氧化,而人參多糖可增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力,降低MDA含量,進(jìn)而減輕腦損傷。本研究結(jié)果顯示,運(yùn)用人參多糖干預(yù)的腦出血大鼠腦勻漿中MDA含量均顯著降低,且劑量越高腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α、MDA含量越趨近于正常,此結(jié)果說明,人參多糖可通過降低自由基所引起的神經(jīng)細(xì)胞過氧化,來抑制MDA表達(dá),降低腦損傷程度。

      神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生與氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及興奮性氨基酸毒性等因素引起線粒體的損傷等有關(guān),通過抗氧自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載等措施來減少細(xì)胞凋亡能起較好的神經(jīng)保護(hù)作用。而人參多糖可降低自由基所引起的神經(jīng)細(xì)胞過氧化。本結(jié)果顯示,人參多糖干預(yù)腦出血模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率相對(duì)較低,并隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞凋亡率不斷下降,說明使用人參多糖干預(yù)腦出血模型大鼠對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞起到抑制凋亡的作用。PI3K不僅具有脂類激活酶活性,還具有蛋白激酶的活性。腦出血后,機(jī)體釋放一些具有酪氨酸激酶受體激活物質(zhì),激活PI3K從而磷酸化細(xì)胞膜上的肌醇。Akt屬于PI3K下游的效應(yīng)分子,活化后可通過控制凋亡的方式,促進(jìn)細(xì)胞存活生物效應(yīng)并實(shí)現(xiàn)調(diào)控生長(zhǎng)因子來誘發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。Bcl-2屬于重要的抗凋亡基因。本結(jié)果顯示,人參多糖對(duì)腦出血模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后,腦出血模型大鼠Bcl-2、Akt、PI3K表達(dá)量相對(duì)較高,說明人參多糖能夠促進(jìn)海馬區(qū)細(xì)胞的增殖,進(jìn)而修復(fù)腦損傷。

      綜上所述,人參多糖治療腦出血,能夠改善大鼠記憶能力,減少腦含水量,抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡,降低腦出血后繼發(fā)性損傷,為臨床治療腦出血提供理論依據(jù)。

      利益沖突:無

      作者貢獻(xiàn)聲明

      鄭希院、翟潔敏:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;李會(huì)琪、趙龍斌:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;高章代:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改

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