檳榔不同制品和檳酚對(duì)金黃地鼠口腔的致癌作用研究*

方 東，朱曉瑜，王慶端，王 軍，許啟泰

[1. 河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004； 2.海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司，海南 定安 571200；3. 河南省(鄭州大學(xué))醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南 鄭州 450052； 4. 河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004]

檳榔為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子，為中國(guó)四大南藥之一。目前全世界嚼食檳榔的消費(fèi)者有7億人，檳榔與香煙、酒、咖啡被稱為全球四大嗜好品[1-2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有許多與檳榔有關(guān)的研究，其中討論最多的當(dāng)屬檳榔是否能夠?qū)е驴谇话┖褪彻馨┑陌l(fā)生?？谇话┍徽J(rèn)為是世界第六大常見(jiàn)癌癥[3]。能引起口腔癌的因素很多，吸煙被認(rèn)為是引起口腔癌發(fā)生發(fā)展的最危險(xiǎn)因素[4]，飲酒也被證實(shí)可增加口腔癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5]，但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)咀嚼檳榔能獨(dú)立升高口腔癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察了檳榔不同制品和檳酚對(duì)金黃地鼠口腔的致癌作用，以期探究咀嚼檳榔是否與口腔癌的發(fā)生存在潛在關(guān)系，從而為人們食用檳榔提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)健康金黃地鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量(100 ± 5)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3 R原則給予人道關(guān)懷，實(shí)驗(yàn)在室溫22～25 ℃、12 h 明暗交替環(huán)境中進(jìn)行。

1.2 藥品、試劑與儀器

成果檳榔選用口味王精制青果食用檳榔，湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)20190621；檳榔黑果及白果，購(gòu)自海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20190722。分別將檳榔黑果、白果、成果切開(kāi)去核，用粉碎機(jī)將果實(shí)磨碎成粉末，用無(wú)菌水潤(rùn)濕，收集于密封袋內(nèi)，置于4 ℃冰箱備用。乙醚購(gòu)于北京 Solarbio科技有限公司，批號(hào)20180917；檳酚由海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司提供，批號(hào)B20190408；肝素，購(gòu)于阿拉丁試劑公司，批號(hào)C1627012；二甲基苯并蒽(DMBA)，購(gòu)自sigma公司，批號(hào)089k7013，將其溶于丙酮，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；質(zhì)量分?jǐn)?shù)9 g/L氯化鈉注射液,購(gòu)自于北京Solarbio科技有限公司，批號(hào)20190427。

1.3 動(dòng)物模型的建立與分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將120只金黃地鼠按照雌雄各半隨機(jī)分成正常對(duì)照組、黑果組、白果組、口味王組、檳酚組、DMBA組，每組20只。采用乙醚將金黃地鼠麻醉，用細(xì)砂紙將金黃地鼠兩側(cè)頰囊磨破，然后分別取檳榔黑果、檳榔白果、口味王、檳酚置于金黃地鼠頰囊中，給藥量以雙側(cè)頰囊填滿為止，放置后不再取出，由金黃地鼠嚼食；DMBA組金黃地鼠雙側(cè)頰囊分別給予0.1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L的DMBA。每周打磨1次，每2天給藥1次，連續(xù)18周。正常對(duì)照組不做任何處理。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

給藥結(jié)束后，肉眼觀察各組金黃地鼠頰囊的變化，處死，取其兩側(cè)頰囊，以40 g/L 多聚甲醛固定，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和二甲苯逐級(jí)脫水透明，石蠟包埋切片后貼于載玻片上，60 ℃烘箱中烤2 h備用。取切片二甲苯脫蠟，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇逐級(jí)脫水后，進(jìn)行組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色和微核染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察、拍照，觀測(cè)各組金黃地鼠頰囊有無(wú)病理變化。為了防止性別因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，將每組金黃地鼠以雌、雄分別統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 各組金黃地鼠雙側(cè)頰囊大體觀對(duì)比

與相同性別的正常對(duì)照組對(duì)比，黑果組、白果組、口味王組、檳酚組金黃地鼠雙側(cè)頰囊大體觀無(wú)明顯差異，DMBA組金黃地鼠口腔出現(xiàn)潰爛和腫瘤結(jié)節(jié)。同組的雌、雄鼠之間對(duì)比，雙側(cè)頰囊大體觀無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

a-b：頰囊黏膜結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，無(wú)潰瘍，無(wú)組織增生c-d：頰囊黏膜出現(xiàn)潰瘍，黏膜內(nèi)出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，口腔周圍黏膜潰爛e-l:頰囊黏膜結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，無(wú)潰瘍，無(wú)組織增生，口腔內(nèi)有少許食物殘?jiān)?/p>

圖1 各組金黃地鼠雙側(cè)頰囊大體觀對(duì)比

2.2 各組金黃地鼠頰囊組織學(xué)對(duì)比

與相同性別的正常對(duì)照組對(duì)比，黑果組、白果組、口味王組、檳酚組金黃地鼠頰囊組織無(wú)明顯異常，細(xì)胞排列規(guī)則，有極性。DMBA組頰囊細(xì)胞排列紊亂，層次不清，癌細(xì)胞大量浸潤(rùn)。同組的雌、雄鼠之間對(duì)比，組織學(xué)改變無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

a-b、e-l：細(xì)胞排列規(guī)則，有極性c-d：細(xì)胞排列紊亂， 層次不清，癌細(xì)胞大量浸潤(rùn)

2.3 各組金黃地鼠頰囊微核染色對(duì)比

與相同性別的正常對(duì)照組對(duì)比，黑果組、白果組、口味王組、檳酚組金黃地鼠微核分裂不明顯，而DMBA組有明顯的微核分裂現(xiàn)象。同組的雌、雄鼠之間對(duì)比，微核分裂現(xiàn)象無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖3。

a-b、e-l：細(xì)胞排列規(guī)則，微核染色較少c-d：細(xì)胞分布紊亂，微核染色數(shù)目多

3 討 論

引起口腔癌的危險(xiǎn)因素眾多，其中吸煙、飲酒、病毒感染最為常見(jiàn)[3]，近年來(lái)專家學(xué)者開(kāi)始研究檳榔是否對(duì)口腔癌的發(fā)生發(fā)展具有影響。我國(guó)檳榔產(chǎn)區(qū)主要集中在海南島中部、南部、東南部等地，種植面積和總產(chǎn)量占全國(guó)的 99%，2000-2011 年呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì)，2010年以后總產(chǎn)值已達(dá)35億元以上[7]?？梢哉f(shuō),對(duì)于主產(chǎn)地而言，檳榔的經(jīng)濟(jì)價(jià)值已經(jīng)非常突出。在此背景下，研究檳榔對(duì)人們?nèi)粘Ｉ钆c健康的影響顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除DMBA組的金黃地鼠的頰囊組織發(fā)生癌變、微核分裂增多之外，檳榔不同制品組未見(jiàn)異常，表明單獨(dú)喂食檳榔各制品的金黃地鼠的雙側(cè)頰囊并未發(fā)生癌變。當(dāng)然，此結(jié)果不能排除因?yàn)閯?dòng)物的數(shù)量較少且檳榔致癌的發(fā)病率較低而未觀察到檳榔不同制品致癌的可能。