逆針灸對過敏性哮喘大鼠血清IL-2含量及肺組織GATA-3蛋白表達的影響*

華金雙，邵素菊，王培育，張 君，何竹青，鄭 潔，田 麗，徐 寧，胡曉京，楊京京

(河南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046)

逆針灸是指在無病或者疾病即將發(fā)生之時，運用針刺或者艾灸的方法來提高機體的免疫力，從而防止疾病的發(fā)生，達到治未病作用的一種方法。課題組的前期研究表明[1-2]，逆針灸可以啟動機體內(nèi)源性的保護機制，抵抗隨后可能發(fā)生的疾病損害。支氣管哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應性、可逆性氣道阻塞和氣道重塑為主要特征的慢性氣道疾病[3],針灸在減輕氣道炎癥及降低氣道高反應性方面具有較好的效果[4-5]，但是在哮喘欲發(fā)而未發(fā)階段，給予逆針灸干預是否能減輕哮喘急性發(fā)作還知之甚少。本研究通過觀察逆針灸對過敏性哮喘大鼠血清白介素-2(IL-2)含量和肺組織中轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3抗體(GATA-3)蛋白表達的影響，探討逆針灸對過敏性哮喘大鼠的預保護機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康雄性SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量160～180 g，由河南省實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(豫)2017-0001，動物使用許可證號為SYXK(豫)2015-0005。實驗過程中對動物的處置嚴格遵守中國科學技術部2006年發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。動物自由飲水和攝食，定期更換墊料。室溫為20～22 ℃，濕度60%～70%，通風良好。剔除疾病、意外死亡等不符合實驗要求者。

1.2 試劑與儀器

卵蛋白(OVA)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號20180521；氫氧化鋁干粉,上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品，批號20180411；質(zhì)量分數(shù)9 g/L氯化鈉注射液，河南科倫藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號A18020101-2；GATA-3一抗，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，批號BA0885；無菌針灸針，直徑0.25 mm、長度13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品, 批號212160613；細艾條，南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司產(chǎn)品，批號2016-11-20。晶體管超聲霧化器，鞍山市無限電一廠產(chǎn)品；RM2015型切片機，德國Leica公司產(chǎn)品；BX43型光學顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與模型的建立

在水和標準飼料充足條件下飼養(yǎng)大鼠1周，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、逆針組和逆灸組。

除正常對照組外，其余各組動物均以新鮮配制的質(zhì)量分數(shù)為100 g/L的復合OVA抗原溶液(每升抗原液中含有OVA 100 g，氫氧化鋁干粉100 g)1 mL進行腹腔注射致敏。在實驗的第1天和第8天各注射1次使大鼠致敏。第15天，將大鼠置于密閉的霧化箱內(nèi)，由壓縮霧化器噴入質(zhì)量分數(shù)為10 g/L的卵蛋白溶液20 min激發(fā)哮喘，每天1次，連續(xù)7 d。7 d后，以如下標準判別模型是否成功：霧化初期大鼠表現(xiàn)為煩躁不安，抓耳撓腮，呼吸急促，活動頻繁；后期大鼠出現(xiàn)俯伏不動，毛發(fā)無光澤，反應遲鈍、精神萎靡不振。

1.4 各組大鼠的處理方法

逆針組：造模的同時，在致敏階段給予隔天1次的針刺干預，連續(xù)2周；激發(fā)階段給予每天1次的針刺干預，連續(xù)1周。取穴：肺俞(雙)、大椎、風門(雙)、足三里。采用直徑0.25 mm、長度13 mm針灸針，大椎直刺5 mm，風門、肺俞直刺6 mm，足三里直刺7 mm。每次20 min，每隔10 min行針1次,平補平瀉法。若適逢給予大鼠致敏或激發(fā)，則先針刺后致敏或激發(fā)。

逆灸組：造模的同時，在致敏階段給予隔天1次的溫和灸干預，連續(xù)2周；激發(fā)階段給予每天1次的艾灸干預，連續(xù)1周。取穴：肺俞(雙)、大椎、風門(雙)、足三里。持細艾條行溫和灸法，艾條距離上述穴位2～3 cm，每次灸20 min。若適逢給予大鼠致敏或激發(fā)，則先艾灸后致敏或激發(fā)。

正常對照組用生理鹽水代替卵蛋白。正常對照組和模型對照組每天給予同樣的抓握刺激，不做任何治療。

1.5 檢測指標

1.5.1 標本取材

最后1次治療結(jié)束后24 h內(nèi)用質(zhì)量分數(shù)100 g/L的水合氯醛3.5 μL/g腹腔注射麻醉大鼠，脫頸椎處死大鼠，迅速打開胸腹腔，暴露出腹主動脈，用10 mL注射器抽取血液3～5 mL，置于普通試管，靜置30 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清，-20 ℃保存。取右肺中下葉，用4 ℃質(zhì)量分數(shù)為9 g/L的氯化鈉注射液漂洗干凈，立即放入新鮮配制的質(zhì)量分數(shù)為40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h以上，用石蠟包埋，切片，待用于肺組織免疫組化檢測。

1.5.2 肺組織形態(tài)學改變

肺組織常規(guī)石蠟包埋，二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木素-伊紅(HE)染色，常規(guī)脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織形態(tài)學改變。

1.5.3 IL-2含量

采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清IL-2含量，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.4 肺組織GATA-3蛋白表達

采用免疫組織化學法檢測。石蠟組織切片，切片用二甲苯脫蠟3次，各10 min，依次在無水乙醇、體積分數(shù)950 mL/L乙醇、800 mL/L乙醇、750 mL/L乙醇中浸泡，蒸餾水脫蠟至水化。將切片放入檸檬酸鹽修復液中，高壓修復2 min，在室溫條件下自然冷卻，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加30 g/L 雙氧水(即內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑)，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加一抗，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗，37 ℃避光20 min，放入PBS中洗3次，每次5 min。配制DAB顯色液，滴加到切片上，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察，測定陽性免疫染色強度及面積，結(jié)果采用平均光密度(MOD)表示。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織形態(tài)學改變

正常對照組大鼠肺部未見明顯異常，肺泡及支氣管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，氣道及周圍血管有少量炎性細胞浸潤。模型對照組大鼠氣管及小血管周圍可見大量的炎性細胞浸潤；支氣管管腔狹窄，管壁增厚；氣道黏膜下組織水腫明顯。逆針組和逆灸組均可見氣管及其周圍炎性細胞浸潤，管腔狹窄，氣道黏膜水腫，但與模型對照組對比炎性細胞浸潤程度明顯降低，管腔狹窄及水腫明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學檢查(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠血清IL-2含量對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清IL-2含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針組和逆灸組IL-2含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。逆針組和逆灸組之間IL-2含量對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組 別nIL-2/(ng·L-1)正常對照組10315.00±59.86模型對照組10719.80±73.27??逆針組10559.40±60.12??##逆灸組10618.80±67.61??##

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.01。

2.3 各組大鼠肺組織GATA-3蛋白表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠GATA-3平均光密度值升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針組和逆灸組GATA-3平均光密度值降低，差異有統(tǒng)計學意義(P值依次為P<0.05、P<0.01)。逆針組和逆灸組之間GATA-3蛋白表達對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

組 別nGATA-3正常對照組100.021±0.007模型對照組100.054±0.014??逆針組100.039±0.009?#逆灸組100.035±0.010?##

注：與正常對照組對比，*P<0.05；**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05; ##P<0.01。

3 討 論

治未病理論是中醫(yī)學中承載著預防觀念的學術思想，其內(nèi)涵與西醫(yī)學從治療疾病向預防疾病轉(zhuǎn)變的戰(zhàn)略思想有異曲同工之處。《素問·四氣調(diào)神大論篇》就已經(jīng)提出“是故圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂”。唐代孫思邈更是將疾病分為未病、欲病、已病3個層次，認為“上醫(yī)醫(yī)未病之病，中醫(yī)醫(yī)欲病之病，下醫(yī)醫(yī)已病之病”。在疾病發(fā)生前，采用合適的方法阻斷疾病的發(fā)生，延緩疾病的發(fā)展，減少機體的損害，對防治疾病具有重大意義。

目前針灸治療哮喘的研究內(nèi)容頗豐，但多集中在哮喘發(fā)作以后的治療效果和機制方面[6-7]，關于逆針灸對哮喘的預防性保護作用資料較少，尚未檢索到詳細報道。本研究在以往逆針灸作用機制研究的基礎上，繼續(xù)探討逆針灸對過敏性哮喘大鼠的預保護作用及其機制。

哮喘屬中醫(yī)學“哮病”范疇。當機體在某些誘發(fā)因素如感冒、呼吸道細菌感染、吸入過敏原等作用下，就會成為哮喘高危人群，若不及時治療便會進入哮喘持續(xù)發(fā)作階段。當哮喘發(fā)作時，多種炎性細胞和細胞因子參與氣道炎性反應，其中Thl和Th2細胞的分化平衡狀態(tài)對哮喘的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用。研究報道，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3是影響Thl與Th2細胞分化的關鍵決定因子[8]。其中GATA-3是Th2細胞分化必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，其表達在Th2譜系分化的細胞中顯著上調(diào)[9]。GATA-3是GATA的家族成員，僅在Th2細胞中表達。GATA-3一方面通過上調(diào)IL-4、IL-5等Th2型細胞因子的表達，活化趨化因子，吸引EOS、中性粒細胞等向呼吸道的炎癥部位聚集和浸潤，從而促進哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展；另一方面還可通過抑制Thl特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet促進Th2細胞分化，對多種靶基因起到促進和抑制作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，GATA-3 基因敲除大鼠合成Th2 細胞因子的能力顯著降低，無法形成由Th2介導的氣道炎癥[11]。近年來，4q24-27染色體區(qū)域所含基因被認為與過敏性疾病密切相關[12]。IL-2基因恰位于4q27，IL-2是Thl細胞因子，可刺激T細胞MHCⅡ類抗原的表達，并產(chǎn)生γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α等細胞因子從而發(fā)揮效應功能。另外，IL-2還可促進B細胞增殖和分泌抗體，產(chǎn)生Th2型細胞因子的效應。外周血或血漿中IL-2水平的變化會影響Thl與Th2分化平衡[13]。研究[14]報道，哮喘患者血清中IL-2的水平明顯高于正常人，且IL-2的濃度與FEV1%預計值呈負相關。

本實驗結(jié)果表明，與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清IL-2含量明顯升高，這與上述研究結(jié)果一致，而逆針組和逆灸組血清IL-2含量明顯降低(P<0.05)。此說明逆針灸可以顯著抑制哮喘大鼠血清中促炎因子的分泌，減輕氣道炎癥。同時逆針組和逆灸組還可以顯著降低哮喘大鼠肺組織中GATA-3蛋白表達，表明逆針灸可通過降低GATA-3蛋白表達，抑制由Th2介導的氣道炎癥，從而減輕哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

逆針灸是中醫(yī)治未病的重要手段。在哮喘欲發(fā)而未發(fā)階段，通過增強機體免疫力，調(diào)動內(nèi)源性保護機制是防止哮喘持續(xù)發(fā)作和減輕哮喘癥狀的有效措施。本實驗在哮喘未發(fā)階段即給予針、灸干預，結(jié)果表明, 能有效減輕哮喘大鼠的癥狀，抑制氣道炎癥反應和氣道重塑 ,其作用機制可能與下調(diào)血清IL-2含量和降低肺組織中GATA-3蛋白表達有關，提示對哮喘大鼠具有預保護作用。