UPLC-Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用快速分析瑤藥黃紅鉆的成分＊

韋 瑋，張 萌，周江煜，郝二偉，謝安然，陸海蘭，王愛玲，梁瓊平，侯小濤**，鄧家剛**

（1. 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南寧 530200；2. 農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心 南寧 530200；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530200；4. 金秀瑤醫(yī)醫(yī)院，廣西金秀545700）

瑤醫(yī)藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的重要組成部分，在漫長(zhǎng)醫(yī)療實(shí)踐中，瑤醫(yī)根據(jù)藥物的性味功效、臨床應(yīng)用特點(diǎn)及形態(tài)特征，歸納出104 味效果較佳、流傳廣泛、較為常用的瑤藥，并稱為“老班藥”（即祖上傳下的藥物之意），根據(jù)功能主治可以分為“五虎”“九?！薄笆算@”以及“七十二風(fēng)”?！笆算@”類瑤藥中含有苯丙素類、萜類、黃酮類、生物堿、有機(jī)酸、甾體等多種成分。具有抗癌、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、抗衰老、抑菌、保肝、鎮(zhèn)靜抗癲癇等多種作用，傳統(tǒng)瑤醫(yī)認(rèn)為“鉆”類藥物藥效峻猛，能透利關(guān)節(jié)、疏通經(jīng)絡(luò)，多為活血化瘀、行氣、止痛藥，對(duì)瘀阻、濕滯的的患者具有較好的療效，為瑤族民間常用的傳統(tǒng)“打藥”，多用于治療各種“腫癥”[1]。黃紅鉆（wiang hongh nzunx）別名膽草、銅釵風(fēng)、青竹藤，是木犀科植物厚葉素馨（Jasminum pentaneurumHand.-Mazz）的莖葉，在瑤族有著悠久的使用歷史，主要分布于廣東、海南、廣西，屬于鉆類瑤藥“十八鉆”之一。廣西以金秀瑤族自治縣為主要分布區(qū)，此外還分布于上思、靈山、羅城、防城、巴馬、梧州、鹿寨、玉林、上林等地。其味苦、甘、辛，性平；具有止咳化痰、健脾消腫、補(bǔ)腎益肺、祛風(fēng)通絡(luò)等功效；瑤族民間用于崩閉悶（風(fēng)濕痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)）、播沖（跌打損傷）、卡西悶（胃痛）、榮古瓦卡西悶（產(chǎn)后腹痛）以及流心黑身翁（虛弱浮腫）等[2]。

瑤藥在瑤族民間使用廣泛，但卻缺少系統(tǒng)的現(xiàn)代藥學(xué)研究。由于歷史的原因，瑤族沒有形成自己的文字，瑤醫(yī)藥傳承僅靠口授心傳，面臨著失傳的風(fēng)險(xiǎn)，急需進(jìn)行系統(tǒng)的研究并加以保護(hù)。近些年來，為了促進(jìn)瑤醫(yī)藥的發(fā)展和保護(hù)，《瑤醫(yī)效方選編》《中國瑤醫(yī)學(xué)》《中國瑤藥學(xué)》《實(shí)用瑤醫(yī)學(xué)》《瑤醫(yī)常用植物藥化學(xué)與藥理研究》和《中國現(xiàn)代瑤藥》等著作相繼出版，為瑤藥的研究及保護(hù)等提供了技術(shù)依據(jù)。為了提升瑤藥材質(zhì)量，推廣瑤藥，《廣西壯族自治區(qū)瑤藥藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）》已收載部分“十八鉆”類瑤藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本課題組承擔(dān)了“廣西瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第二卷）品種研究項(xiàng)目”《瑤藥材黃紅鉆質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)研究（部分）》，前期已開展黃紅鉆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及化學(xué)成分[3，4]研究，結(jié)果表明，黃紅鉆中主要有酚酸類及環(huán)烯醚萜苷類化合物，包括反式肉桂酸、10-hydroxyoleoside-11-methyl ester、10-hydroxyoleoside dimethyl ester、10- (3-hydroxy-4-methoxybenzoate) -ligustroside、別旁茶苷等，但還未對(duì)黃紅鉆的全成分進(jìn)行系統(tǒng)分析研究。

本研究采用UPLC-Q-Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，利用其具有高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)，結(jié)合自動(dòng)觸發(fā)多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)，得到黃紅鉆化學(xué)成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)分離的對(duì)照品和數(shù)據(jù)庫，比對(duì)各色譜峰的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，首次對(duì)黃紅鉆主要成分進(jìn)行了全面準(zhǔn)確的快速識(shí)別，共鑒定了23個(gè)成分，其中包括有機(jī)酸類8個(gè)、生物堿類3個(gè)、木脂素類3個(gè)以及環(huán)烯醚萜苷類5 個(gè)。黃紅鉆療效確切，但尚無有關(guān)黃紅鉆藥理活性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的文獻(xiàn)報(bào)道，這與其在瑤族地區(qū)的廣泛應(yīng)用是不匹配的。

本研究通過對(duì)黃紅鉆成分的全面分析，以及前期進(jìn)行的黃紅鉆化學(xué)成分的分離鑒定[3，4]，可以為黃紅鉆質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供定量、定性的指標(biāo)性成分；同時(shí)也為黃紅鉆藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用等提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UPLC-Q Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），離子源采用HESI 源（heated ESI），Thermo Gold C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.9 μm），Xcalibur 3.0 軟 件（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），十萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），粉碎機(jī)（天津太斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

乙腈為質(zhì)譜純（默克公司，美國），超純水（Milli-Q SP Regent Water system，美國），乙酸銨為質(zhì)譜純（Fisher，美國），甲醇為分析純（科隆化學(xué)品有限公司，成都），甲酸為色譜純（東京化成工業(yè)株式會(huì)所，日本），其余試劑為分析純。

1.3 藥材

黃紅鉆藥材采于廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為木犀科厚葉素馨（Jasminum pentaneurumHand.-Mazz）的莖葉。

2 方法

2.1 UPLC檢測(cè)條件

色譜柱為Thermo Gold C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：乙腈A-0.1%甲酸水（含10 mmol 乙酸銨）B；梯度洗脫：0-2.0 min，5%A；2.0-42.0 min，5%-95%A；42.0-47.0 min，95%A；47.1-50 min，95%-5%A；流速為0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL；柱溫35℃。

2.2 MS檢測(cè)條件

離子源采用HESI源（heated ESI），噴霧電壓：3.5 kV(+)、3.2 kV (-)，鞘氣體積流量：30 μL·min-1，離子傳輸管溫度：320°C；輔助氣體流量：10 μL·min-1；輔助氣溫度：300°C。掃描方式Full MS/dd-MS2 模式，采用正、負(fù)離子同時(shí)采集，掃描m/z范圍：100-1500，其中一級(jí)Full MS 全掃描選擇分辨率為70000 FWHM，dd-MS2的二級(jí)掃描選擇分辨率為17500 FWHM，特定離子掃描模式為“off”，噴霧氣為氮?dú)?，碰撞氣為高純氮?/p>

2.3 供試品溶液

干燥黃紅鉆藥材粉碎，過65 目篩，精密稱取黃紅鉆藥材粉末1 g（精確至0.0001 g），置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足失重，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

3 結(jié)果與分析

取黃紅鉆供試品溶液及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.1”、“2.2”項(xiàng)下色質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，分別得到正、負(fù)離子及質(zhì)譜圖（圖1）。使用Xcalibur 3.0軟件對(duì)高分辨質(zhì)譜信息進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道、中醫(yī)藥資料庫及對(duì)照品進(jìn)行化合物的確認(rèn)（表1）。

圖1 黃紅鉆UPLC-Q-Exactive MS的TLC圖

3.1 有機(jī)酸類

有機(jī)酸類化合物廣泛存在于自然界植物中。本實(shí)驗(yàn)從黃紅鉆中共鑒定出了8 個(gè)有機(jī)酸類化合物，分別為莽草酸、原兒茶醛、丁香醛、苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、對(duì)羥基安息香醛、阿魏酸乙酯以及6-姜酚。酚酸類化合物在負(fù)離子模式下一般能夠產(chǎn)生豐度較大的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜中一般都會(huì)丟失中性分子（如H2O、CO、CO2等）。以莽草酸為例，該化合物分子式為C7H10O5，負(fù)離子模式下，得到m/z173.0450[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，響應(yīng)值較正離子模式好。該化合物的二級(jí)離子碎片信息主要有m/z137.0241、111.0449、93.0343，分 別 對(duì) 應(yīng)[M-H-2H2O]-、[M-HH2O-CO2]-、[M-H-2H2O-CO2]-，根據(jù)該化合物的精確分子量、二級(jí)裂解方式以及文獻(xiàn)報(bào)道[5]，確定該化合物為莽草酸。

3.2 生物堿類

在ESI+模式下，共鑒定出3 個(gè)生物堿類化合物。化合物5保留時(shí)間為1.49 min，一級(jí)質(zhì)譜顯示該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z123.0553 [M+H]+，進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，碎片離子為m/z106.0290，是由于準(zhǔn)分子離子丟失一個(gè)NH2后形成，繼續(xù)丟失一中性分子CO得到碎片離子?；衔?保留時(shí)間為3.81 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z263.1749 [M+H]+，對(duì)母離子進(jìn)行MS/MS 掃描，主要產(chǎn)生2 個(gè)碎片離子，分別為m/z245.1643[M+H-H2O]+，150.1279[M+H-H2O-C5H5NO]+，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，鑒定該化合物為氧化槐果堿。同理，根據(jù)峰19 的準(zhǔn)分子離子峰m/z336.1226 [M+H]+，以及二級(jí)質(zhì)譜碎片離子m/z318.0760[M+H-CH3-H-2H]+、292.0963[M+H-CH3-H-CO]+，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6]，鑒定該化合物為小檗堿。

3.3 木脂素類

表1 UPLC-Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜對(duì)黃紅鉆化學(xué)成分的鑒定分析結(jié)果

木脂素類化合物為苯丙素氧化聚合而成。黃紅鉆中鑒定的該類化合物均為苯丙素二聚體并帶糖的木脂素類。這些化合物均易脫去葡萄糖或者鼠李糖殘基。比如刺五加苷及松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷均丟失葡萄糖基。苷元在正離子模式下容易丟失H2O中性分子。此外，苷元可斷開呋喃環(huán)從而得到相應(yīng)的碎片離子。以松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷[7]為例，該化合物的保留時(shí)間為11.48 min，正離子模式下該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z538.2275[M+NH4]+，準(zhǔn)分子離子峰直接丟失一個(gè)葡萄糖和H2O 中性分子得到m/z341.1372[M+H-Glc-H2O]+，此后分子中的呋喃環(huán)開裂并伴隨丟失苯環(huán)上的一分子甲氧基從而得到m/z175.0754[M+Na-Glc-H2O-C7H7O2-OCH3]+。

圖2 莽草酸的質(zhì)譜主要裂解途徑

圖3 氧化槐果堿質(zhì)譜主要裂解途徑

圖4 松脂醇-β-D-吡喃葡萄糖苷質(zhì)譜主要裂解途徑

3.4 環(huán)烯醚萜苷類

本實(shí)驗(yàn)鑒定了5個(gè)環(huán)烯醚萜苷類成分。根據(jù)前期結(jié)果，黃紅鉆中的含量較大的主要成分為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類，且化合物21 為新的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物[3]。除了化合物10 以外，其他化合物均有丟失162的葡萄糖分子，得到苷元離子。對(duì)苷元離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，這類化合物的苷元大多易失去H2O、CO2、CO、CH3OH 等中性分子。下面以藥材中含量較大的化合物7、20、21為例說明其裂解途徑。

化合物7 的保留時(shí)間為5.31 min，在負(fù)離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜信息顯示，該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z419.1194[M-H]-，以此為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，碎片離子為m/z375.1263，為丟失1 個(gè)中性CO2分子；碎片離子為m/z239.0562，是母離子丟失1個(gè)Glc及1 個(gè)中性H2O 分子；碎片離子m/z195.0899 是準(zhǔn)分子離子峰接連丟失1 分子Glc、1 分子H2O 和1 分子CO2所致。根據(jù)裂解規(guī)律，并與對(duì)照品比對(duì)并結(jié)合文獻(xiàn)[3,8]，鑒定該化合物為10-hydroxyoleoside 11-methyl ester（圖5）。

化合物20的保留時(shí)間為15.37 min，負(fù)離子模式下給出該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z549.1686[M-H]-，以此為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到m/z239.4657的碎片離子，為母離子丟失1 分子的Glc，隨后丟失1分子的肉桂酸酰基所致。除此以外，還得到了其他離子碎片m/z221.0453[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O]-、177.0554[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2]-、145.0292[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2-CH3OH]-、117.0344[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2-CH3OH-CO]-。根據(jù)裂解規(guī)律，并與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)[3,8]，鑒定該化合物為Jasminoside（圖6）。

化合物21 為前期從黃紅鉆中分離鑒定的新的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物。與其他環(huán)烯醚萜苷類似，該化合物的負(fù)離子模式給出準(zhǔn)分子離子峰為m/z689.2081[M-H]-，以該母離子進(jìn)行MS/MS 掃描，首先得到二級(jí)碎片離子m/z527.1548[M-H]-，為母離子丟失一分子Glc 所致。二級(jí)質(zhì)譜離子m/z389.0891，為母離子連續(xù)丟失一個(gè)Glc，一個(gè)對(duì)羥基苯乙烷分子，一個(gè)H2O得到。m/z389.0891 的碎片離子陸續(xù)丟失CH2O 及中性分子CO2得到m/z359.1129 及m/z359.1129。m/z291.0877為該化合物經(jīng)類似于非裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物母環(huán)斷裂，生成1,6F-特征碎片離子的模式而產(chǎn)生[8]。根據(jù)裂解規(guī)律，并與對(duì)照品比對(duì)，鑒定該化合物為10-(3-hydroxy-4-methoxy-benzoate)-ligustroside（圖7）。

圖5 化合物10-hydroxyoleoside 11-methyl ester的質(zhì)譜裂解途徑

圖6 化合物jasminoside的質(zhì)譜裂解途徑

4 討論與結(jié)論

本研究通過高分辨質(zhì)譜正、負(fù)離子模式檢測(cè)黃紅鉆藥材中所含成分，根據(jù)各成分所形成的色譜峰在質(zhì)譜中的色譜保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜裂解規(guī)律和二級(jí)質(zhì)譜離子碎片信息，并結(jié)合對(duì)照品的質(zhì)譜信息和參考文獻(xiàn)，快速地闡明了黃紅鉆中的成分并首次鑒定出黃紅鉆中的23 個(gè)化學(xué)成分，包括有機(jī)酸類8個(gè)、生物堿類3 個(gè)、木脂素類3 個(gè)、環(huán)烯醚萜苷類5 個(gè)，并對(duì)有機(jī)酸、生物堿、木脂素、環(huán)烯醚萜苷四類成分的裂解途徑進(jìn)行了分析總結(jié)。本研究為其后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究以及更深入的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

圖7 化合物10-(3-hydroxy-4-methoxy-benzoate)-ligustroside的質(zhì)譜裂解途徑