冠心病血瘀證代謝組學(xué)研究進(jìn)展＊

周思遠(yuǎn)，熊興江，何浩強(qiáng)，2，陳恒文，傅夢(mèng)薇，2，劉蘭椿，2，王 階＊＊

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029）

冠心?。–oronary heart disease，CHD）是目前患病率與死亡率最高的疾病之一，已成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在緩解癥狀與改善遠(yuǎn)期預(yù)后方面有較好療效，但也存在二級(jí)預(yù)防藥物治療不耐受等問(wèn)題[1]。中醫(yī)藥治療冠心病已積累了數(shù)千年的經(jīng)驗(yàn)，早在《金匱要略·胸痹心痛短氣病》便有記載，現(xiàn)代病證結(jié)合理論下的冠心病中醫(yī)防治更是為提高臨床療效提供了新的方法。血瘀證是CHD 最主要證型之一[2]，活血化瘀是其基本治法。然而，目前關(guān)于冠心病血瘀證的發(fā)生機(jī)制以及活血化瘀中藥的作用機(jī)制研究仍未深入，一定程度上限制了中醫(yī)藥在冠心病的臨床應(yīng)用與研究。因此，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)客觀化地闡明“冠心病-血瘀證-活血化瘀中藥”診療體系的科學(xué)內(nèi)涵具有重要意義。代謝組學(xué)能將基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)變異以及環(huán)境因素變化有效橋接，從最終的“生化表型”來(lái)把握生物體的整體功能狀態(tài)[3]。通過(guò)發(fā)掘CHD發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵代謝物，進(jìn)一步探索其生物學(xué)作用，可為CHD 發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。此外，代謝組學(xué)技術(shù)能通過(guò)對(duì)機(jī)體代謝組的識(shí)別和量化研究，系統(tǒng)展示機(jī)體正常生理或病理刺激下的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為CHD 血瘀證的生物學(xué)基礎(chǔ)與活血化瘀中藥作用機(jī)制的揭示提供了有力工具[4]。

1 冠心病代謝組學(xué)研究概述

利用代謝組學(xué)開(kāi)展冠心病研究已有數(shù)十年，最早用于生物標(biāo)志物的探索，近年來(lái)已轉(zhuǎn)向發(fā)病機(jī)理與藥效機(jī)制的研究。隨著技術(shù)革新，目前應(yīng)用于代謝組學(xué)研究的方法包括核磁共振技術(shù)（Nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)、氣相色質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）等。利用這些技術(shù)，學(xué)者們已發(fā)現(xiàn)較多的可用于CHD 診斷的潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)，通過(guò)進(jìn)一步的細(xì)胞功能學(xué)與藥理學(xué)研究，分析了這些可能的標(biāo)志物在CHD 病理機(jī)制中的作用。已發(fā)現(xiàn)與CHD 相關(guān)的代謝物包括N乙酰神經(jīng)氨酸[5]、氧化脂質(zhì)[6]、不飽和脂肪酸[7]、苯乙酰谷氨酰胺[8]、磷脂酰膽堿[9]、氨基酸[10]、二十碳五烯酸[12]等。

研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)代謝物可能與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。一項(xiàng)研究對(duì)2324 例接受冠脈造影者的血漿代謝物進(jìn)行檢測(cè)，鑒定出36個(gè)CHD相關(guān)代謝產(chǎn)物，其中N-乙酰神經(jīng)氨酸水平與冠心病事件呈顯著正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸能通過(guò)激活Rho/ROCK-JNK/ERK 信號(hào)通路誘發(fā)心肌損傷[5]。另一研究發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與絕經(jīng)期婦女患冠心病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的氧化脂質(zhì)，包括2種羥基磷脂酰膽堿以及花生四烯酸的3種氧化衍生物（15-HETE、5-HETE 和11-HETE），色譜分析顯示HETE 譜與花生四烯酸的非酶氧化機(jī)制一致[6]。

體內(nèi)代謝物還與不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。一項(xiàng)涉及7256 例人群的前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)血漿中較高的單不飽和脂肪酸、苯丙氨酸水平與心肌梗死等不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)，而較高水平的二十二碳六烯酸、omega-6脂肪酸與低風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[7]。另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)苯乙酰谷氨酰胺與心肌梗死等主要不良心血管事件相關(guān)，藥理學(xué)研究提示，其作用可能與其通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)血小板高反應(yīng)性有關(guān)[8]。

代謝物可作為CHD 的潛在生物標(biāo)志物。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酰膽堿、皮質(zhì)醇和甘油磷脂酰膽堿可用于區(qū)分冠心病患者與健康者[9]。有研究發(fā)現(xiàn)2-異丙基蘋果酸，5-羥基吲哚乙醛，4-羥基馬尿酸和腺苷可作為冠心病潛在的生物標(biāo)志物，涉及的信號(hào)通路包括氨基酸代謝和脂肪酸代謝等[10]。另有學(xué)者篩選出溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、單酸甘油酯等9種代謝物作為冠心病診斷的潛在生物標(biāo)志物，基于上述代謝物建立的CHD 預(yù)測(cè)模型顯示出良好的CHD 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)能力[11]。

干預(yù)代謝物水平或能抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)經(jīng)ω-3 多不飽和脂肪酸飲食喂養(yǎng)的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積小且穩(wěn)定，其體內(nèi)二十碳五烯酸代謝物——18-羥基二十五碳烯酸、17,18-環(huán)氧二十碳四烯酸水平升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些代謝物可以通過(guò)NF-kB 信號(hào)通路減少內(nèi)皮細(xì)胞活化，抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[12]。

2 基于代謝組學(xué)的冠心病血瘀證生物學(xué)基礎(chǔ)

近年來(lái)，學(xué)者們從理化指標(biāo)、基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等不同層面探索了冠心病血瘀證的生物學(xué)基礎(chǔ)[1]，但仍未完全闡釋其發(fā)生機(jī)制。代謝組學(xué)可以從整體揭示生命活動(dòng)的調(diào)控規(guī)律，并通過(guò)探索代謝物之間的相互作用闡釋機(jī)體的生理、病理機(jī)制，是揭示證候本質(zhì)的有效途徑[4]。目前研究者已初步篩選出一些CHD血瘀證的潛在生物代謝標(biāo)志物，包括葡萄糖、丙氨酸、檸檬酸等（表1）。

2.1 基于“同病異證”的冠心病血瘀證代謝物研究

“同病異證”是中醫(yī)臨床診斷的特色，明確證候的鑒別是臨床治療的關(guān)鍵。氣為血之帥，氣虛與氣滯是導(dǎo)致血瘀證形成的常見(jiàn)因素，探討CHD 不同血瘀證辨證分型的物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)CHD 血瘀證證候本質(zhì)的把握具有重要意義。研究顯示CHD 心血瘀阻證與氣虛血瘀證患者血漿代謝物存在差異，心血瘀阻證中檸檬酸、琥珀酸、3-羥基丁酸、谷氨酸等含量升高，不飽和脂肪酸、組氨酸等含量降低，氣滯血瘀證患者的血漿代謝產(chǎn)物譜與心血瘀阻證患者無(wú)明顯差異[13]。然而，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CHD 氣滯血瘀證與氣虛血瘀證存在氨基酸水平的差異，組氨酸、瓜氨酸等含量在CHD 氣虛血瘀證中升高[14]。另有研究顯示，溶血磷脂酰膽堿，亞油酸、花生四烯酸、鞘氨醇類物質(zhì)構(gòu)成了CHD 氣虛血瘀證代謝產(chǎn)物譜[15]。

血不利則為水，瘀血與痰濁常相互膠結(jié)共同為病，在病情復(fù)雜時(shí)有難以區(qū)分之弊，探索導(dǎo)致二者差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)臨床精準(zhǔn)辨證及“同病異治”內(nèi)涵的揭示具有重要意義[16]。研究發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證和痰濁證既有共性代謝物，也有特異性代謝物，特異性代謝物主要有蘋果酸、葡萄糖、甘氨酸、棕櫚烯酸等，其中蘋果酸、葡萄糖等在血瘀證中含量較痰濁證升高[17]。另一項(xiàng)研究顯示CHD 血瘀證和痰濁證患者血漿的差異代謝物主要涉及氨基酸代謝（亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸），嘌呤代謝（尿酸、泛醌）和嘧啶代謝（脫氧尿嘧啶核苷酸、尿苷）[18]。CHD 血瘀證與痰濁證患者的尿液代謝物也存在一定差異，血瘀證尿液中檸檬酸、葡萄糖、肌酐、氧化三甲胺、馬尿酸等含量低于痰濁證，而膽汁酸、組氨酸的含量高于痰濁證組[19]。以上研究提示，代謝組學(xué)技術(shù)在CHD 血瘀證與其他證型鑒別方面有較大應(yīng)用前景。

表1 冠心病血瘀證潛在生物代謝標(biāo)志物

2.2 基于“異病同證”的冠心病血瘀證代謝物研究

“證同治同，異病同治”是中醫(yī)臨床的重要治則，比較冠心病血瘀證與其他疾病血瘀證相關(guān)代謝物的異同，有利于進(jìn)一步明確CHD 血瘀證形成的物質(zhì)基礎(chǔ)并全面揭示血瘀證的證候內(nèi)涵。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丙氨酸[20,21]、乳酸[20,21]、葡萄糖[20-22]、檸檬酸[20,23]、組氨酸[23]、纈氨酸[21,24]等可作為CHD 血瘀證潛在生物代謝標(biāo)志物。相關(guān)學(xué)者在慢性心力衰竭[25]與2 型糖尿病[26]血瘀證患者的血漿代謝產(chǎn)物譜中發(fā)現(xiàn)了相似代謝物，其中丙氨酸、乳酸、纈氨酸、丙酮酸等構(gòu)成了慢性心力衰竭血瘀證血漿代謝產(chǎn)物譜[25]，丙酮、甘氨酸、檸檬酸、延胡索酸等代謝物含量的異常構(gòu)成了2型糖尿病血瘀證患者代謝特征[26]。此外，有學(xué)者利用UHPLC-TOF-MS 聯(lián)用技術(shù)分析了CHD 血瘀證與肝硬化血瘀證異病同治的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)果顯示檸檬酸、組氨酸、羥基丁酸、谷氨酰胺等7種內(nèi)源性代謝物為血瘀證的潛在生物標(biāo)志物[27]。

尿液是人體代謝終產(chǎn)物，冠心病血瘀證患者也存在特異性的尿液代謝物，檸檬酸、丙氨酸、葡萄糖、纈氨酸等代謝物含量的異常構(gòu)成了不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者的代謝組學(xué)特征[28]。另有學(xué)者在乙肝肝硬化血瘀證患者的尿液代謝產(chǎn)物譜中也發(fā)現(xiàn)了相似代謝物，乙肝肝硬化血瘀證的潛在代謝標(biāo)志物主要包括檸檬酸、丙氨酸、D-葡萄糖、甘氨鵝脫氧膽酸等[29]。以上結(jié)果提示，丙氨酸、檸檬酸、乳酸、葡萄糖等代謝物含量的異常可能是導(dǎo)致血瘀證形成的小分子物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 基于代謝組學(xué)的活血化瘀中藥作用機(jī)制

方證對(duì)應(yīng)是中醫(yī)臨證的基本思維模式，活血化瘀是治療CHD 血瘀證的基本治法，但相關(guān)活血化瘀中藥干預(yù)CHD 血瘀證的作用機(jī)制尚未闡明，一定程度上影響了中藥在臨床的應(yīng)用。代謝組學(xué)技術(shù)能夠揭示藥物作用于機(jī)體產(chǎn)生的復(fù)雜代謝產(chǎn)物組變化，并提供藥物作用途徑和作用靶點(diǎn)等方面的信息，可為闡明活血化瘀中藥藥效機(jī)制提供新的手段[30]。已有研究發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀膠囊[31]、血府逐瘀湯[32,34]、復(fù)方丹參滴丸[33]、心可舒片[35]、桃紅四物湯[36]、血栓心脈寧片[37]、麝香保心丸[38]等活血化瘀中藥可以通過(guò)影響一些體內(nèi)關(guān)鍵代謝物及信號(hào)通路，調(diào)整脂肪酸、磷脂、膽汁酸、氨基酸等物質(zhì)代謝發(fā)揮改善心肌能量代謝、調(diào)整脂質(zhì)代謝、抑制磷脂過(guò)氧化、影響類固醇激素生物合成等作用，這些關(guān)鍵代謝物及代謝通路的發(fā)現(xiàn)也有望為CHD 血瘀證的治療提供靶點(diǎn)。

活血化瘀中藥干預(yù)CHD 血瘀證與改善心肌能量代謝密切相關(guān)。一項(xiàng)研究利用UPLC-QTOF/MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)血府逐瘀膠囊糾正了CHD 血瘀證大鼠體內(nèi)肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶1 蛋白的過(guò)表達(dá)，使L-肉堿、游離脂肪酸、乙酰肉堿含量增加，提示血府逐瘀膠囊能減輕心肌細(xì)胞的過(guò)度消耗狀態(tài)，并提供正常能量供應(yīng)[31]。血府逐瘀湯則能促進(jìn)脂肪酸β氧化及糖酵解產(chǎn)生ATP供能并保護(hù)心肌細(xì)胞，其促進(jìn)脂肪酸β氧化與下調(diào)脂肪酸、四羧酸和順式烏頭酸相關(guān)，其促糖酵解與下調(diào)2-脫氧葡萄糖減輕對(duì)N-糖基化和糖酵解的抑制作用相關(guān)[32]。此外，復(fù)方丹參滴丸亦可通過(guò)調(diào)節(jié)心臟能量代謝改善心肌缺血，檸檬酸和3-羥基丁酸可能是復(fù)方丹參滴丸潛在的治療靶點(diǎn)[33]。

活血化瘀中藥還可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制磷脂過(guò)氧化。研究顯示血府逐瘀湯可以上調(diào)鳥(niǎo)脫氧膽酸和糖膽酸促進(jìn)膽汁酸代謝增加膽固醇流出而調(diào)節(jié)血脂；同時(shí)通過(guò)下調(diào)溶血磷脂酸含量，抗血小板聚集和血管平滑肌收縮[34]。血府逐瘀膠囊主要通過(guò)糾正磷脂酶A2 的過(guò)表達(dá)，降低溶血磷脂酰膽堿含量，減少磷脂過(guò)氧化物含量[31]。靶向干預(yù)脂肪酸、磷脂代謝可能是活血化瘀中藥發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一，研究顯示，心可舒片可使心肌梗死大鼠的異常代謝物趨于正常，其中L-乙酰肉堿、鞘氨醇、花生四烯酸等13種代謝物與脂質(zhì)代謝相關(guān)[35]。桃紅四物湯也主要通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸、甘油磷脂代謝發(fā)揮治療作用，甘油磷膽堿、馬尿酸、吲哚基硫酸鹽等可能是桃紅四物湯潛在的抗凝、降脂作用靶點(diǎn)[36]。

活血化瘀中藥的治療作用與影響類固醇激素的生物合成相關(guān)。研究顯示血栓心脈寧片可以通過(guò)調(diào)節(jié)CHD 血瘀證大鼠皮質(zhì)酮、3α,21-二羥基-5β-孕烯-11,20-二酮等代謝物含量，影響類固醇激素生物合成[37]。麝香保心丸則可以通過(guò)抑制皮質(zhì)酮、醛固酮、皮質(zhì)醇和腎上腺素等類固醇激素的生物合成，降低與心肌肥大有關(guān)的代謝產(chǎn)物的水平，逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死的病理改變[38]。

4 小結(jié)與展望

綜上，代謝組學(xué)技術(shù)可以從整體的“生化表型”來(lái)把握生物體的整體功能狀態(tài)，在CHD 血瘀證病理基礎(chǔ)及活血化瘀中藥作用機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究成果顯示，CHD 血瘀證的差異代謝物包括氨基酸、葡萄糖、有機(jī)酸等，丙氨酸、葡萄糖、檸檬酸等可作為潛在的診斷標(biāo)志物，心肌能量代謝、脂質(zhì)代謝、磷脂過(guò)氧化、類固醇激素生物合成可能是活血化瘀中藥的主要作用途徑。CHD 血瘀證的代謝組學(xué)研究雖取得上述進(jìn)展，但也存在一些不足。首先，目前的代謝組學(xué)分析技術(shù)存在一定局限性，尚不能對(duì)生物體所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面定性定量分析，導(dǎo)致采用不同檢測(cè)方法可能獲得不同結(jié)果[39]。其次，尚無(wú)統(tǒng)一、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳飿颖静杉c處理規(guī)范，一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與可重復(fù)性[40]。此外，CHD 血瘀證生物學(xué)基礎(chǔ)研究存在樣本量不足且缺乏驗(yàn)證等問(wèn)題，尚未形成辨證分型的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)?；钛鲋兴幾饔脵C(jī)制研究停留在關(guān)鍵代謝物及代謝通路探明階段，藥物作用下整體代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變尚不明確。

針對(duì)上述問(wèn)題，我們?cè)谖磥?lái)的研究中可以采取如下策略：①完善目前的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)，探索更為廣譜、通用的代謝組學(xué)檢測(cè)方法；建立統(tǒng)一的生物樣本采集與處理規(guī)范，提高實(shí)驗(yàn)人員科研素養(yǎng)，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程的嚴(yán)謹(jǐn)性、可重復(fù)性。②擴(kuò)大研究的樣本量，進(jìn)一步挖掘與驗(yàn)證CHD 血瘀證的差異代謝產(chǎn)物譜，探索統(tǒng)一的診斷和療效評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物；也可以從已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CHD 血瘀證潛在代謝標(biāo)志物出發(fā)，對(duì)這些代謝物涉及的生物合成、表達(dá)等生物學(xué)事件展開(kāi)研究，深入探究其在代謝網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用。③充分利用現(xiàn)有的CHD 血瘀證基因、蛋白質(zhì)等組學(xué)研究成果，將不同組學(xué)數(shù)據(jù)科學(xué)整合并系統(tǒng)分析，構(gòu)建基于多組學(xué)技術(shù)的CHD 血瘀證的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。④聯(lián)合應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)，建立不同組學(xué)信息間的相互聯(lián)系，探索代謝物與基因、蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而系統(tǒng)詮釋病證結(jié)合內(nèi)涵，多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，也有利于克服單一平臺(tái)研究可能造成的實(shí)驗(yàn)誤差[41]。⑤采用細(xì)胞代謝組學(xué)等新興技術(shù)，部分生物過(guò)程只發(fā)生在細(xì)胞中，細(xì)胞系代謝產(chǎn)物譜可作為整體代謝物研究的有效補(bǔ)充，并可直接與基因、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)聯(lián)用，在疾病機(jī)制與藥物機(jī)理研究中前景廣闊[42]。