脂聯(lián)素受體在人牙齦成纖維細(xì)胞中的表達(dá)研究

王麗美，支 敏，呂沛穎，高鵬飛，藺 晨，楊艷艷，王永蘭

牙周炎是以菌斑微生物為始動因子的感染性疾病。大量流行病學(xué)研究表明,牙周疾病與肥胖(特別是腹型肥胖)密切相關(guān)[1-3]。脂聯(lián)素(Adiponectin, APN)是脂肪組織產(chǎn)生的生物活性分子，作為一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它可促進(jìn)脂肪酸的氧化、增加胰島素敏感性、抗炎等[4-5]。脂聯(lián)素表達(dá)水平在肥胖與牙周炎患者中均下降[6-7]。脂聯(lián)素與其受體結(jié)合發(fā)揮生理作用，目前發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體中發(fā)揮作用的主要為兩種：脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(adiponectin receptor 2,AdipoR2)[8]。脂聯(lián)素在與受體結(jié)合后，激活其位于膜內(nèi)的N端，使其和APPL1接頭蛋白相連接，激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)和氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)-α配體，參與葡萄糖、脂肪代謝調(diào)節(jié),發(fā)揮抗炎、抗糖尿病等作用[9-10]，因此在靶組織中AdipoR1和AdipoR2表達(dá)量的改變均有可能直接影響脂聯(lián)素的作用效能。

對肥胖相關(guān)疾病的研究[1]表明:肥胖不僅可以降低血清脂聯(lián)素水平，還可以降低靶器官AdipoR1和AdipoR2水平，使其對脂聯(lián)素的敏感性下降，形成 “脂聯(lián)素抵抗”，進(jìn)一步產(chǎn)生胰島素抵抗[11]。然而對于牙周組織而言，牙周炎癥環(huán)境對脂聯(lián)素受體表達(dá)的影響至今仍存在爭議。Nokhbehsaim等[12]認(rèn)為在人牙周膜細(xì)胞中P.gLPS促進(jìn)了脂聯(lián)素受體的表達(dá)，而Yamaguchi等[13]則認(rèn)為牙周炎癥狀態(tài)會下調(diào)人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs)脂聯(lián)素受體的表達(dá)。脂聯(lián)素受體的表達(dá)水平與牙周炎的關(guān)系存在爭議，有必要進(jìn)一步研究,從而為闡釋肥胖與牙周炎相關(guān)性的內(nèi)在機(jī)制提供依據(jù)。本研究通過腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、APN刺激HGFs并測定其脂聯(lián)素受體表達(dá)的情況來探討脂聯(lián)素受體表達(dá)與牙周炎癥的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HGFs的培養(yǎng)及分組 選取自2017年3月—2017年5月在天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科就診的需要拔除埋伏阻生智齒患者，共5位(年齡18～24歲，平均22歲)。排除患有全身系統(tǒng)性疾病如糖尿病、心血管病等，妊娠，吸煙，近3個月內(nèi)使用抗生素史者，患者知情同意(經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會審查同意)。

術(shù)中收集新鮮且色形質(zhì)正常、無明顯炎癥的牙齦組織,運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代HGFs并進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞傳至4～6代時(shí)將細(xì)胞接至12孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為4組，每組4孔：空白對照組(10%FBS培養(yǎng)基)；TNF-α刺激組(50 ng/mL TNF-α+10% FBS培養(yǎng)基刺激)；P.gLPS刺激組(0.1 μg/mLP.gLPS+10% FBS培養(yǎng)基刺激)；APN刺激組(1 μg/mL APN+10% FBS培養(yǎng)基刺激)。

1.1.2 主要試劑及儀器 RT-PCR試劑盒(sigma公司，美國)；引物(生物公司，上海)；P.gLPS(InvivoGen公司，美國)；TNF-α (Peprotech公司,英國)；APN(Peprotech公司,英國 )。

1.2 方法

1.2.1 HGFs的培養(yǎng)與鑒定 運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代HGFs并進(jìn)行傳代,通過顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察與細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)法-SP法鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為中胚層來源的人牙齦成纖維細(xì)胞,且不含上皮細(xì)胞。

1.2.2 RT-PCR檢測 Trizol提取人牙齦成纖維細(xì)胞總RNA, superRTcDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,引物序列:AdipoR1(169 bp) ：(5′-CGAGAGGGCCTAGGATTGGA-3′)和(5′-CTGATGGTAGACAAGCCGGG-3′), AdipoR2 (213 bp)：(5′-AGACACGCGGATCAACTCAC-3′)和(5′-TGCACCCCAATCGGTT-TTCT-3′)，β-actin：(268 bp)(5′-CCATCCTGGCCT-CGCTGT-3′) 和(5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′),95 ℃預(yù)變性約5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，電泳，凝膠成像儀拍照，目的基因與β-actin灰度積分比值表示基因表達(dá)水平。

1.2.3 TNF-α或P.gLPS或APN刺激HGFs 取5代HGFs(1×105個/孔)均勻鋪在12孔板上，于37 ℃，5%的CO2溫箱內(nèi)孵育2 d使細(xì)胞貼壁融合至80%時(shí)。根據(jù)組別在12孔板內(nèi)每孔依次加入50 ng/mL TNF-α 2 mL，0.1 μg/mLP.gLPS 2 mL，1 μg/mL APN 2 mL，空白對照(10%FBS培養(yǎng)基)2 mL,每組均設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2溫箱孵育1 d，將培養(yǎng)液丟棄，提取培養(yǎng)0、0.5、12、24 h的HGFs的總mRNA。

1.2.4 real-time PCR檢測 用real-time PCR檢測各組HGFs中AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，2-△△ct法處理數(shù)據(jù)，與對照組進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用IBM SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素ANOVA方差分析(完全隨機(jī)設(shè)計(jì))，以P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HGFs的培養(yǎng)與鑒定

組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)HGFs，3 d后可見組織邊緣隱約有成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞游出,細(xì)胞極性較強(qiáng)，排列呈漩渦狀(圖1A)。當(dāng)細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，進(jìn)行首次傳代，隨培養(yǎng)時(shí)間和代數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)單一呈長梭型(圖1B)。免疫組化結(jié)果顯示細(xì)胞抗波形蛋白染色陽性(圖2A)，抗角蛋白染色陰性(圖2B)，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為中胚層來源，并未混雜任何上皮源性細(xì)胞。

A:原代HGFs第3天細(xì)胞從組織周圍爬出；B:第4代HGFs

圖1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

Fig.1Morphological observation (×100)

A: 細(xì)胞抗波形蛋白染色陽性;B:細(xì)胞抗角蛋白染色陰性

圖2HGFs組織來源的鑒定(免疫組織化學(xué)SP法)

Fig.2Identification of source of HGFs(Immunohistochemistry SP)

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

如圖3所示，健康HGFs中有AdipoR1、AdipoR2的表達(dá)，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物顯示目的基因片段與預(yù)期一致，且AdipoR2的條帶亮度更高。

圖3 RT-PCR檢測健康HGFs AdipoR1、AdipoR2的表達(dá)

2.3 real-time PCR檢測結(jié)果

與空白對照組相比，各時(shí)間點(diǎn)TNF-α均明顯下調(diào)HGFs的AdipoR2 mRNA的表達(dá)，上調(diào)HGFs的AdipoR1的 mRNA的表達(dá)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，圖4A。與空白對照組相比，在培養(yǎng)0.5、12 h時(shí)P.gLPS上調(diào)HGFs的AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在24 h時(shí)，與空白對照組相比，P.gLPS上調(diào)HGFs的AdipoR2表達(dá)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，圖4B。與空白對照組相比，在0.5、12、24 h時(shí)，APN均顯著上調(diào)了HGFs的AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，圖4C。

各組AdipoR1、AdipoR2 mRNA水平是與空白對照組數(shù)值比較的相對率，*:AdipoR1基因水平和對照組相比,P<0.05,**:AdipoR2基因水平和對照組相比,P<0.05

A: 50 ng/mL TNF-α刺激；B: 0.1 μg/mLP.gLPS刺激；C: 1 μg/mL APN刺激

圖4不同因子對HGFs脂聯(lián)素受體AdipoR1、AdipoR2 mRNA表達(dá)的影響

Fig.4Effects of different factors on the expression of adiponectin receptor genes (AdipoR1and AdipoR2) in HGFs

3 討 論

2003年，Yamauchi等[14]首先從細(xì)胞內(nèi)克隆出兩個脂聯(lián)素特異性受體亞型，將其命名為AdipoR1/R2。國內(nèi)外關(guān)于脂聯(lián)素受體在牙周組織的表達(dá)研究不完全相同[13，15]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)人牙齦成纖維細(xì)胞只表達(dá)兩種脂聯(lián)素受體，這與文獻(xiàn)[16]的結(jié)論一致。同時(shí)本研究表明AdipoR2條帶較AdipoR1更亮，在人牙齦成纖維細(xì)胞中，脂聯(lián)素受體表達(dá)可能以AdipoR2為主，這與Yamaguchi等[13]關(guān)于小鼠牙齦組織脂聯(lián)素受體的表達(dá)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步探討需要siRNA實(shí)驗(yàn)和蛋白實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

在炎癥狀態(tài)的牙齦組織中，TNF-α作為一個多向性感染細(xì)胞因子發(fā)揮著及其重要的作用。在牙周炎患者的齦溝液和牙齦組織中，TNF-α含量明顯增高[17]。本實(shí)驗(yàn)所用TNF-α因子濃度和刺激時(shí)間基于Yamaguchi等的研究[13]，且在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中人重組TNF-α(50 ng/mL)被證實(shí)可明顯抑制HGFs脂聯(lián)素受體表達(dá)。循環(huán)脂聯(lián)素水平與血清TNF-a水平負(fù)相關(guān)[18]，具體機(jī)制不明確，可能是由于TNF-α可抑制PPAR-a通路[19]和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活化通路[20]。TNF-α有兩個不同受體，TNF受體-1(TNF receptor-1,TNFR1)和TNF受體-2(TNF receptor-2,TNFR2)。目前主要觀點(diǎn)認(rèn)為，TNFR1介導(dǎo)了核因子(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路的激活和成骨分化的抑制[21]，也有研究表明TNFR1誘導(dǎo)的信號通路可以破壞胰島素作用[22]。我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)0.5、12、24 h時(shí)TNF-α明顯下調(diào)AdipoR2 mRNA的表達(dá)，上調(diào)AdipoR1 mRNA表達(dá)。這與Yamaguchi等[13]的研究不同，其結(jié)果表明：高濃度TNF-α在0.5 h和1 h明顯抑制AdipoR1的表達(dá),對AdipoR2的表達(dá)無影響。AdipoR1在與APN結(jié)合后主要激活下游AMP及肝臟激酶B1(liver kinase B1,LKB1)分子，激活A(yù)MPK通路，促進(jìn)脂肪酸氧化與葡萄糖攝入[23]；而AdipoR2在與APN結(jié)合后主要激活下游PPARs(包括如PPAR-α和PPAR-γ配體)，激活PPAR信號通路，促進(jìn)脂肪酸氧化[24]。AMPK及PPARs等信號通路的激活在一定程度上可以拮抗NF-κB信號通路[25]，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型(抗炎型)極化[26]從而抑制炎癥反應(yīng)。有研究證實(shí)脂聯(lián)素可能主要通過AdipoR2調(diào)節(jié)胰島素敏感性和發(fā)揮抗炎作用[27]，且本研究表明在HGFs中脂聯(lián)素受體表達(dá)以AdipoR2為主,因此TNF-α下調(diào)AdipoR2 mRNA的表達(dá)可能是TNF-α降低脂聯(lián)素敏感性和發(fā)揮促炎作用的重要原因，而TNF-a對牙周組織AdipoR1表達(dá)的影響尚需更多研究來證實(shí)和解釋。

P.gLPS作為重要毒力因子常被用于體外構(gòu)建牙周炎模型[28]。本研究表明：P.gLPS促進(jìn)HGFs表達(dá)AdipoR1和AdipoR2,這與Nokhbehsaim等關(guān)于人牙周膜細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)[12]結(jié)論一致:在1 d時(shí)，P.g顯著增加了脂聯(lián)素受體AdipoR1的mRNA表達(dá),在1 d和3 d上調(diào)脂聯(lián)素受體AdipoR2的表達(dá),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Yamaguchi等[13]則認(rèn)為P.gLPS并不會影響到牙齦成纖維細(xì)胞中脂聯(lián)素受體表達(dá)水平。目前各研究結(jié)果存在爭議，需更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)P.gLPS誘導(dǎo)的信號通路在HGFs脂聯(lián)素受體表達(dá)中的作用。

有研究在對牙周炎患者的血清及牙齦組織活檢中，發(fā)現(xiàn)其脂聯(lián)素濃度下降[29]。那么脂聯(lián)素濃度的降低是否會影響脂聯(lián)素受體的表達(dá)？本實(shí)驗(yàn)所用APN濃度為1 μg/mL(在正常齦溝液脂聯(lián)素濃度范圍內(nèi)[6])，同時(shí)本研究表明，脂聯(lián)素在該濃度作用下相較于空白對照組明顯上調(diào)AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)，這提示我們脂聯(lián)素在一定程度上可對其自身受體正向調(diào)節(jié)。在牙周炎患者中，脂聯(lián)素的表達(dá)水平下降[29]，有可能引起脂聯(lián)素受體AdipoR1/2的mRNA表達(dá)下降，使脂聯(lián)素作用效能在一定程度上降低，產(chǎn)生脂聯(lián)素抵抗。這一結(jié)果與Nokhbehsaim等的研究[12]并不一致，他們的結(jié)果表明，脂聯(lián)素在第1天時(shí)下調(diào)了兩個脂聯(lián)素受體的表達(dá)，截至目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然存在爭議，脂聯(lián)素對自身受體的調(diào)控仍然需要進(jìn)一步研究。

牙周炎的發(fā)生和發(fā)展極其復(fù)雜，由一復(fù)雜的菌斑生物微環(huán)境來調(diào)控，其它細(xì)菌致病成分或者炎癥因子，如白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等是否會影響脂聯(lián)素受體的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。在牙周炎癥狀態(tài)下，脂聯(lián)素受體表達(dá)下降，及時(shí)輔助APN受體激動劑等局部藥物治療對于控制炎癥、防止病情加重有一定意義[30-31]。此外，脂聯(lián)素受體研究可以進(jìn)一步了解脂聯(lián)素的作用及牙周炎、肥胖的分子機(jī)制，從而為設(shè)計(jì)以AdipoR1和AdipoR2受體激動劑作為靶點(diǎn)藥物輔助應(yīng)用于肥胖伴牙周炎患者治療提供基礎(chǔ)。最近已有研究表明，脂聯(lián)素受體激動劑AdipoRon (APR)在肥胖相關(guān)糖尿病動物模型中不但可以降低血糖含量，還可以顯著降低炎癥牙齦中CC趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2,CCL2)和IL-6的含量，同時(shí)降低破骨細(xì)胞數(shù)量進(jìn)而改善牙周狀況[31]，證實(shí)APR可作為肥胖相關(guān)性糖尿病合并牙周炎患者的多效靶向藥物，為這類患者的有效治療帶來福音。