蒼術(shù)白術(shù)配伍對于脾虛泄瀉小鼠的藥效學比較研究*

邯鄲市中醫(yī)院

孫勝振 劉曉蘭△ 楊麗萍△ 劉會麗△(邯鄲 056000)

提要 目的：對蒼術(shù)白術(shù)配伍治療實驗性小鼠脾虛泄瀉的作用及機制進行比較研究。方法：將50只小鼠灌胃番瀉葉水煎液14 d，復制脾虛泄瀉模型。將造模成功的小鼠隨機分為模型組，陽性組，配伍組、蒼術(shù)組和白術(shù)組，每組10只。另設(shè)空白組小鼠10只。各組小鼠連續(xù)灌胃給藥或給水7 d,末次給藥后，用半固體營養(yǎng)糊法檢測小鼠胃殘留率和小腸推進率；取血漿，Elisa法檢測其中小鼠胃動素(MTL)和小鼠血管活性腸肽(VIP)含量，取結(jié)腸組織，Elisa法檢測其中白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量，western blot法檢測其中水通道蛋白3(AQP3) 蛋白表達水平。結(jié)果：蒼術(shù)、白術(shù)和兩藥配伍皆能明顯增加脾虛泄瀉小鼠的胃殘留率和血漿中的MTL含量，明顯降低小腸推進率和血漿VIP、結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α含量，上調(diào)APQ3的蛋白表達水平。其中，蒼術(shù)對IL-1β、TNF-α和AQP3的蛋白表達影響較為顯著，而白術(shù)則重在調(diào)節(jié)胃腸運動和激素水平。結(jié)論：蒼術(shù)和白術(shù)配伍能夠相輔相成，對小鼠脾虛泄瀉有較好的改善作用。

蒼術(shù)、白術(shù)六朝前統(tǒng)稱為“術(shù)”。[1]術(shù)從本經(jīng)時期就受到了各大醫(yī)家的關(guān)注。隨著藥物與方劑使用的進展，兩藥的區(qū)別與配伍逐漸被提出。其中，蒼術(shù)以苦溫燥濕為主，為運脾要藥；白術(shù)以健脾益氣為主，為補脾要藥；兩藥配伍，一散一補，可使水濕得以運化，脾胃納運如常，因此可用于食欲不振、惡心嘔吐、脘腹脹滿、腸鳴泄瀉等癥的治療。[2]但兩藥的配伍尚缺少現(xiàn)代研究。在本項研究中，通過復制脾虛泄瀉小鼠模型，分別以蒼術(shù)、白術(shù)和兩藥配伍進行治療，就兩藥配伍的作用和可能機制進行探討。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠60只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(18±5)g，購自北京斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，動物許可證編號為：1103241911029433。動物飼養(yǎng)于SPF級實驗室，恒溫恒濕，12 h白晝，12 h黑夜，自由采食滅菌飼料和去離子水。

1.2 試劑與試藥

蒼術(shù)、白術(shù)和番瀉葉均購自邯鄲市中醫(yī)院，經(jīng)邯鄲市中醫(yī)院主任藥師鑒定為正品。蒼術(shù)、白術(shù)及蒼術(shù)白術(shù)配伍均分別以水浸漬30 min，并分別加水煎煮2次，第1次15 min，第2次10 min，合并2次水煎液，濃縮至1 g生藥/mL；番瀉葉以水浸漬30 min，加水煎煮2次，每次10 min，合并2次水煎液，濃縮至1 g生藥/mL；參苓白術(shù)散，北京同仁堂股份有限公司(18101033)，以去離子水配置為 0.45 g/mL混懸液。半固體營養(yǎng)糊，將羧甲基纖維素、奶粉、糖、淀粉加水和碳素墨水調(diào)和為糊狀物。小鼠胃動素(MTL)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0543)；小鼠血管活性腸肽(VIP)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0082)；小鼠白細胞介素1β(IL-1β)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0583)；小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0030)；水通道蛋白3(AQP3)兔多克隆抗體，美國Abacm生物科技有限公司(ab153694)。

1.3 實驗儀器

酶標儀(美國 Thermo 公司)，迷你電泳槽、迷你轉(zhuǎn)印儀(美國 Bio-Rad 公司)，化學發(fā)光儀(法國 Vilber Lourmat 公司)。

2 實驗方法

2.1 模型制備

依照文獻中方法，50只小鼠每日灌胃番瀉葉水煎液0.2 mL/10 g體質(zhì)量，連續(xù)14 d，復制脾虛泄瀉小鼠模型。造模后，小鼠出現(xiàn)腹瀉、糞便稀溏、納呆、精神萎靡、活動減少、體質(zhì)量減輕，則為造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的小鼠按體質(zhì)量隨機分為模型組、陽性組(灌胃參苓白術(shù)散混懸液)、蒼術(shù)組(灌胃蒼術(shù)水煎液)、白術(shù)組(灌胃白術(shù)水煎液)和配伍組(灌胃蒼術(shù)白術(shù)水煎液)，每組10只。另設(shè)空白組小鼠10只。各給藥組小鼠每日灌胃給藥1次，空白組、模型組給水1次，給藥、水容量為0.2 mL/10 g體質(zhì)量，連續(xù)7 d。

2.3 指標檢測

各組小鼠末次給藥后禁食12 h，摘眼球取血后快速處死，檢測小鼠胃殘留率和小腸推進率；剪取結(jié)腸約3 cm，凍存。

2.3.1 半固體營養(yǎng)糊法測定小鼠胃殘留率和小腸推進率：末次給藥后，禁食12 h，小鼠灌胃半固體營養(yǎng)糊0.5 mL/只，20 min后，小鼠取血后快速處死，開腹，剪取胃和幽門至回盲部腸管，置于托盤上。稱量胃質(zhì)量和清理內(nèi)容物后的胃空質(zhì)量，按照下式計算胃殘留百分率；測量小腸全長和半固體營養(yǎng)糊在小腸內(nèi)的推進距離，并按下式計算小腸推進百分率。

胃殘留率(%)=

推進率 (%) =

2.3.2 Elisa法檢測小鼠血漿中MTL和VIP含量：小鼠摘眼球取血，將血采集至加有肝素鈉的EP中，混勻后得血漿。以Elisa檢測試劑盒檢測血漿中MTL和VIP含量。

2.3.3 Elisa法檢測小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α含量：剪取小鼠結(jié)腸約1 cm，縱向剖開，生理鹽水沖洗后勻漿。以Elisa檢測試劑盒檢測勻漿上清液中IL-1β、TNF-α含量。

2.3.4 western blot法檢測小鼠結(jié)腸組織中AQP3的蛋白表達水平：取結(jié)腸組織約500 mg，加入蛋白裂解液2 mL充分裂解，離心取上清，進行蛋白質(zhì)含量測定后，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，8%脫脂奶粉封閉2 h，加入目標蛋白的一抗4℃過夜，再以二抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光儀檢測。以目標條帶光密度值比內(nèi)參β-actin條帶光密度值作為目標蛋白的相對表達量。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 實驗結(jié)果

3.1 對小鼠胃殘留率和小腸推進率的影響

與空白組相比，模型組小鼠的胃殘留率顯著降低(P<0.01)，小腸推進率則顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、配伍組和白術(shù)組的小鼠胃殘留率顯著提高(P<0.01)，小腸推進率顯著降低(P<0.01)；蒼術(shù)組則胃殘留率明顯提高(P<0.05)，小腸推進率明顯降低(P<0.05)。與配伍組相比，蒼術(shù)組胃殘留率差異有顯著性(P<0.05)。詳見表1。

表1 對小鼠胃殘留率和小腸推進率的影響

3.2 對小鼠血漿中MTL和VIP含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠血漿中MTL含量顯著降低(P<0.01)，而VIP含量則顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性組小鼠血漿MTL含量顯著升高(P<0.01)，配伍組和白術(shù)組也明顯升高(P<0.05)，蒼術(shù)組亦升高但差異無顯著性(P>0.05)；陽性組、配伍組和白術(shù)組小鼠血漿中VIP含量顯著降低(P<0.01)，蒼術(shù)組也明顯降低(P<0.05)。與蒼術(shù)組相比，陽性組、配伍組和白術(shù)組小鼠血漿中MTL含量均明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

3.3 小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和TNF-α含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、配伍組和蒼術(shù)組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，白術(shù)組也明顯降低(P<0.05)；配伍組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α含量顯著降低(P<0.01)，陽性組和蒼術(shù)組也明顯降低(P<0.05)，白術(shù)組亦降低但差異無顯著性(P>0.05)。詳見表3。

表2 對小鼠血漿中MTL和VIP含量的影響

組別nIL-1β/(pg·mgpro-1)TNF-α/(pg·mgpro-1)空白組1016.53±3.68??19.08±3.94??模型組1022.32±7.4325.24±4.72陽性組1017.59±4.16??20.53±5.34?配伍組1016.41±3.20??19.60±4.38??蒼術(shù)組1016.59±4.30??20.11±4.06?白術(shù)組1018.12±2.75?22.73±4.04

3.4 對小鼠結(jié)腸組織中AQP3的蛋白表達水平的影響

與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中AQP3的蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、配伍組和蒼術(shù)組的小鼠結(jié)腸組織中AQP3的蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，白術(shù)組也明顯升高(P<0.05)。與白術(shù)組比，陽性組、配伍組和蒼術(shù)組的小鼠結(jié)腸組織中AQP3的蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖1、圖2。

注：與模型組相比，*PPP

圖2 對小鼠結(jié)腸組織中AQP3的蛋白表達水平的影響

4 討論

中醫(yī)學認為，脾主運化，乃后天之本，氣血生化之源。若過量服用寒涼藥物，或飲食失節(jié)，或勞倦傷脾均可致脾失健運，水谷津液輸布失常，水濕清濁不分，混雜而下，出現(xiàn)泄瀉。主要表現(xiàn)為消瘦乏力、納少、身弱怯冷、四肢倦怠、脘腹脹滿、便溏腹瀉等。[3]中醫(yī)常以健脾祛濕為法進行治療，療效顯著，蒼術(shù)、白術(shù)為其中常用藥物。蒼術(shù)，為菊科植物茅蒼術(shù)[Atractylodeslancea(Thunb.) DC.]或北蒼術(shù)[Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.]的干燥根莖，中醫(yī)認為，其味苦性溫，具有燥濕化濁、升陽散郁之功效。[4]白術(shù)，為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，中醫(yī)認為，其味甘性溫，具有益氣健脾、燥濕和中之功效。[5]二者伍用，其燥濕健脾之功效更著，用于治療寒濕內(nèi)停之帶下清稀，色白量多；脾胃不健，濕邪中阻之食欲不振，納差嘔吐，胸脘滿悶；濕邪下注，水走腸間之腹脹，腸鳴，泄瀉等癥，方如蒼術(shù)丸(《景岳全書》)。[6]

在六朝以前，古人用藥不分蒼術(shù)白術(shù)，統(tǒng)稱為“術(shù)”。[7]陶弘景在《本草經(jīng)集注》中首次明確提出“術(shù)乃有兩種”，宋朝以后將術(shù)分為白術(shù)、蒼術(shù)逐漸得到公認，李時珍在《本草綱目》中記載道：“自宋以為，始言蒼術(shù)苦辛氣烈，白術(shù)苦甘氣和，各自施用，亦頗有理”。[6，8]蒼術(shù)和白術(shù)在臨床應用上的諸多異同也為歷代醫(yī)家所關(guān)注。歷經(jīng)多年臨床應用，中醫(yī)認為，蒼術(shù)性味苦烈，長于燥濕，散多于補；白術(shù)則性味甘潤溫和，功擅健脾，補多于散?，F(xiàn)代研究顯示，兩術(shù)雖同為菊科植物，但其中所含化學成分并不相同。蒼術(shù)中主要含有倍半萜、烯炔、甾體類化合物，白術(shù)則主要含有揮發(fā)油、內(nèi)酯、苷、多糖及氨基酸類化合物。兩藥均具有調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等功能，還能夠抗菌、抗炎、抗衰老及抗氧化。[9-10]本研究旨在從動物實驗層面探討蒼術(shù)、白術(shù)在藥理作用方面的差異及配伍的意義。

“久瀉傷脾”“苦寒傷陽”，瀉下藥大黃、番瀉葉等為味苦性寒之品，過服易損傷脾氣，日久累及脾陽，造成脾失健運兼有虛寒，出現(xiàn)脾虛證候。在本項實驗中，采取長期灌胃番瀉葉水煎液的方法，復制了脾虛泄瀉小鼠模型。造模后，可見小鼠出現(xiàn)腹瀉、糞便稀溏、納呆、精神萎靡、活動減少、體質(zhì)量減輕等脾虛泄瀉表現(xiàn)。胃腸運動功能紊亂是脾虛泄瀉模型的重要特征之一，而胃腸激素水平變化是影響胃腸動力的重要因素。其中，MTL為小腸Mo細胞分泌的多肽，能夠引起胃的收縮運動和小腸的分節(jié)運動，有利于胃腸的吐故納新。[11]VIP的主要作用是松弛腸平滑肌和肛門內(nèi)括約肌，并促進腸道水分和電解質(zhì)的分泌。VIP分泌增多可引起胃腸運動功能紊亂，腸道分泌物增多，進而導致腹瀉。[12]腹瀉常伴隨有消化道炎癥反應，且二者呈正相關(guān)。[13]IL-1β和TNF-α均是由單核細胞分泌的經(jīng)典促炎因子和早期致炎因子，可促進炎性細胞的激活與聚集，引發(fā)并放大腸黏膜炎性損傷。[14-15]AQPs是一類內(nèi)在膜蛋白，又稱水孔蛋白，其在細胞膜上組成孔道，通過控制細胞膜水分進出而調(diào)節(jié)肌體水代謝。結(jié)腸上表達的AQP3是調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)水平衡的主要水通道蛋白之一，其表達量的高低決定著結(jié)腸黏膜對水分的吸收和轉(zhuǎn)運，與腹瀉的發(fā)生密切相關(guān)。[16-17]本項實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組小鼠相比，模型小鼠的胃殘留率、血漿中MTL含量明顯降低，小腸推進率、血漿VIP含量、結(jié)腸組織中IL-1β和TNF-α則明顯升高，結(jié)腸AQP3 的蛋白表達水平顯著降低?？梢?，脾虛泄瀉模型小鼠，由于胃腸道運動功能異常、腸道炎癥，消化道對水分的吸收能力降低，而出現(xiàn)糞便稀溏。

在本研究中，通過給與蒼術(shù)、白術(shù)或兩藥的配伍組方，均能使脾虛泄瀉小鼠的胃殘留率提高，小腸推進率降低，減輕腹瀉癥狀。其作用機制與提高血漿中MTL含量，降低血漿VIP、結(jié)腸組織中IL-1β和TNF-α含量，上調(diào)結(jié)腸AQP3 的蛋白表達水平有關(guān)。繼續(xù)對兩藥及配伍方進行比較，可以發(fā)現(xiàn)，白術(shù)對調(diào)節(jié)胃腸激素水平的作用優(yōu)于蒼術(shù)，而蒼術(shù)抑制炎癥因子的釋放和調(diào)節(jié)水通道蛋白的能力優(yōu)于白術(shù)，與傳統(tǒng)功效描述的蒼術(shù)燥濕力勝，白術(shù)健脾力強相一致。而兩藥相伍，相得益彰，可使中焦得健。