液相芯片技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR在檢測(cè)兒童感染性腹瀉病原體的比較

漢聰慧，曹廣進(jìn)，張福真，胡亮杉，曹東林*，李 凌*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515； 2.廣州市番禺區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 511400; 3.廣東省第二人民醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，廣東 廣州 510317)

感染性腹瀉廣義指各種病原體腸道感染引起的腹瀉，除外霍亂、細(xì)菌性和阿米巴痢疾、傷寒和副傷寒的感染性腹瀉[1]。據(jù)估計(jì)，2016年全球共有40億感染性腹瀉患者，其中160萬(wàn)患者死亡。發(fā)展中國(guó)家的兒童最容易受到影響[2-3]。截至2017年，約53萬(wàn)名5歲以下兒童因腹瀉而死亡[4]，其中大部分發(fā)生在世界上最貧窮的國(guó)家。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布，2018年中國(guó)感染性腹瀉病發(fā)病率為92/10萬(wàn)，病死率為0.001/10萬(wàn)。

多種細(xì)菌、病毒均可引起感染性腹瀉病，且存在2種或2種以上的病毒或(和)細(xì)菌混合感染的情況[5]。研究表明，一年內(nèi)中國(guó)5歲以下兒童出現(xiàn)腹瀉病原體的混合感染可達(dá)到27.60%[5]。腹瀉病患者數(shù)量大、病原體復(fù)雜且多混合感染，目前中國(guó)腸道門(mén)診常規(guī)檢測(cè)包括的感染性腹瀉病原體種類(lèi)有限，特殊檢測(cè)周期長(zhǎng)，存在一定的局限性。液相芯片具有高通量、快速、可靠和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)臨床快速確診[6]。因此，本研究運(yùn)用液相芯片技術(shù)快速檢測(cè)感染性腹瀉病病原體，分析檢出病原體特征，并與實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較，評(píng)價(jià)其在感染性腹瀉病快速診斷中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源：糞便樣品來(lái)自于2017年11月至12月廣東省第二人民醫(yī)院門(mén)診就醫(yī)的96例兒童及0月～5歲嬰幼兒腹瀉患者，其中男性54例、女性42例，年齡中位數(shù)為2.05歲。就診前患兒未服用抗生素、抗病毒及抗阿米巴藥物。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2017-SCZYF-JYK)。

1.1.2 試劑：胃腸道病原體檢測(cè)試劑盒(Luminex公司)；核酸抽提試劑盒(Qiagen公司)；樣品預(yù)處理緩沖液(Biomerieux公司)；Bertin SK38糞便核酸提取微珠試管(Bertin公司)；質(zhì)粒小提試劑盒、切膠回收試劑盒、pMD 19-T載體及氨芐青霉素(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 糞便標(biāo)本的預(yù)處理：將100～150 mg糞便樣品添加到含Bertin SK38微珠的糞便樣品裂解液中。每份樣品加入10 μL的xTAG?MS2作為液相芯片檢測(cè)的內(nèi)參對(duì)照。將預(yù)處理試管渦旋5 min，室溫下靜置10～15 min，再以14 000 r/min離心2 min，得到樣品上清液。

1.2.2 核酸的提?。喝?00 μL的樣品上清液，按照核酸抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最終得到60 μL核酸洗脫液。

1.2.3 液相芯片檢測(cè)

1.2.3.1 多重RT-PCR反應(yīng)：每個(gè)反應(yīng)管中加入xTAG?RNase-free水2.5 μL、5×xTAG?OneStep RT-PCR緩沖液7.5 μL、xTAG?GPP 引物混合物2.5 μL、xTAG?BSA(10 mg/mL)0.5 μL和xTAG?OneStep 酶混合物2.0 μL，共15 μL，配制96例樣品所需試劑量，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。再加入96例樣品核酸洗脫液10 μL/管，陰性對(duì)照中加入xTAG?RNase-free水10 μL。將配好的各PCR管短暫離心。在PCR儀中以53 ℃ 20 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)。

1.2.3.2 多重PCR產(chǎn)物與微球雜交反應(yīng)：在每個(gè)0.2 mL PCR管中加入xTAG?GPP Bead Mix 20 μL、1×SA-PE報(bào)告溶液75 μL、多重RT-PCR產(chǎn)物5 μL，配制成100 μL/管的雜交體系。最后，在提前預(yù)熱至60 ℃的PCR儀中以60 ℃ 3 min、45 ℃ 45 min進(jìn)行分子雜交反應(yīng)。

1.2.3.3 xTAG?GPP檢測(cè)：將PCR管放置于提前預(yù)熱至45 ℃的加熱器，檢測(cè)后使用xTAG?Data Analysis Software (TDAS) 軟件分析結(jié)果。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(探針?lè)?對(duì)1.2.2步驟所提取的核酸進(jìn)行qPCR。qPCR檢測(cè)所用引物序列(表1)[7]，所用基因探針序列(表2)[7]。

1.2.5 多重PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序分析：將多重PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化、挑取單菌落、擴(kuò)大培養(yǎng)、進(jìn)行菌液PCR、瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，最后提取菌液質(zhì)粒送至公司進(jìn)行測(cè)序、BLAST分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequence of real-time PCR

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針序列Table 2 Gene probe sequence of real-time PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料以例數(shù)n、百分率(%)表示，采用SPSS 20.0對(duì)液相芯片與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)，以敏感度和特異度、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為檢測(cè)指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉病原體檢出情況

xTAG?GPP試劑盒共檢出7種病原體63例，陽(yáng)性檢出率為65.63%(63/96)。其中檢出最多的是沙門(mén)氏菌48例(50.00%)，其次是空腸彎曲桿菌20例(20.83%)、A組輪狀病毒16例(16.67%)、諾如病毒14例(14.58%)、腸道腺病毒3例(3.13%)，產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌和大腸桿菌O157均為2例(2.08%)，沒(méi)有檢出霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森桿菌及志賀氏菌。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出62例樣品為陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為64.58%(62/96)。

2.2 兩種方法檢測(cè)結(jié)果的比較

4種病原體(包括沙門(mén)氏菌、A組輪狀病毒、諾如病毒和空腸彎曲桿菌)檢出率均有差異(P<0.05)；液相芯片檢測(cè)7種腹瀉病原體的敏感度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(表3)；正確指數(shù)為82.76～97.62，表明液相芯片檢測(cè)腹瀉病原體的真實(shí)性較高。

表3 液相芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)每種腸道病原體檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 Comparison of liquid-phase chip and real-time PCR method for detection of each intestinal pathogen

-.no data;p.positive;n.negative.

液相芯片與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果相同的共有83例，一致率為86.46%(83/96)，其中真陰性占39.76%(33/83)，真陽(yáng)性占60.24%(50/83)。對(duì)沙門(mén)氏菌、A組輪狀病毒、諾如病毒和空腸彎曲桿菌的kappa值分別為0.79、0.83、0.92和0.91，說(shuō)明兩種方法的一致性好。

經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析可知，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，液相芯片檢測(cè)感染性腹瀉病原體的敏感度為100.00%，特異度為71.74%，陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為100.00%和79.37% (χ2=53.73，P<0.05)。

2.3 混合感染檢出情況

在96例樣品中，液相芯片與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出只感染一種病原體的樣品例數(shù)(百分率)分別為38例(39.58%)、39例(40.63%)，混合感染例數(shù)及病原體檢出種類(lèi)見(jiàn)表4。液相芯片檢出的細(xì)菌混合感染為7例(7.29%)，病毒混合感染為1例(1.04%)，細(xì)菌病毒混合感染為17例(17.71%)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出的細(xì)菌混合感染為7例(7.29%)，病毒混合感染為1例(1.04%)，細(xì)菌病毒混合感染為15例(15.63%)。

3 討論

感染性腹瀉是全球的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[8]。

表4 兩種方法對(duì)混合感染檢測(cè)效果Table 4 Detection of mixed infection by two methods

多種病原體如細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)都能引起腹瀉，在發(fā)展中國(guó)家，沙門(mén)氏菌感染致腹瀉是兒童死亡的主要原因之一[9]。

本研究運(yùn)用液相芯片對(duì)7種細(xì)菌和3種病毒進(jìn)行快速、平行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患兒腹瀉中細(xì)菌性感染較多，這可能與區(qū)域季節(jié)性的細(xì)菌性流行相關(guān)[10]。腹瀉患兒糞便中沙門(mén)氏菌檢出率高達(dá)半數(shù)，這與報(bào)道結(jié)果[11]類(lèi)似；其次為空腸彎曲菌，該厭氧菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，臨床常規(guī)方法如細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定等，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)1周，因此，液相芯片技術(shù)對(duì)以空腸彎曲菌為代表的腸道厭氧菌的檢測(cè)極具優(yōu)勢(shì)[12]。本研究病毒性感染以A組輪狀病毒最多，其次為諾如病毒和腸道腺病毒，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道的感染情況[13-14]一致。上述結(jié)果表明，液相芯片技術(shù)可有效用于感染性腹瀉病原體的快速檢測(cè)。

腹瀉病原體混合感染較常見(jiàn)。本研究液相芯片檢測(cè)出多種細(xì)菌或病毒或細(xì)菌和病毒的混合感染，其中沙門(mén)氏菌、空腸彎曲菌兩種細(xì)菌混合感染比例最高達(dá)72.00%(18/25)，這與報(bào)道的細(xì)菌性混合感染病原體類(lèi)型相似[10]。面對(duì)混合感染時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅耗費(fèi)大量的人力、物力，還可能會(huì)因病原體種類(lèi)較多而延誤最佳治療時(shí)機(jī)，而液相芯片一次能檢測(cè)多種病原體，這對(duì)混合感染的腹瀉病的快速診斷具有重要意義。

本研究中同一份樣品用兩種方法檢出的一致率較高，且液相芯片的敏感度和特異度與報(bào)道結(jié)果[12]相似。對(duì)不一致樣品進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示與qPCR檢出結(jié)果一致，表明液相芯片檢測(cè)中出現(xiàn)了1～3個(gè)病原體的誤檢。液相芯片的假陽(yáng)性可能與產(chǎn)物的切膠回收、克隆等操作有關(guān)，或因上次擴(kuò)增產(chǎn)物密閉不嚴(yán)致所用試劑、加樣槍、環(huán)境出現(xiàn)極微量或微量的非目的核酸污染?？刹扇〉拇胧┌幮詫?duì)照的設(shè)置，試劑、加樣槍和環(huán)境的預(yù)處理和分區(qū)操作等，實(shí)現(xiàn)腹瀉病原體的準(zhǔn)確檢測(cè)。

綜上所述，無(wú)論是單一腹瀉病原體感染還是混合感染，與qPCR相比，液相芯片技術(shù)都顯示出了高通量、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。液相芯片技術(shù)對(duì)臨床快速檢測(cè)腹瀉病原體具有積極意義。