宮腔灌注人絨毛膜促性腺激素改善多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜容受性

孫家珍，潘瑞洋，申素芳*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 1.生殖醫(yī)學科； 2.心血管內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種多因性的內(nèi)分泌綜合征，是育齡期女性內(nèi)分泌失調(diào)和排卵性不孕的常見原因之一，影響著女性生育、代謝及心理健康[1]。大量的證據(jù)表明復雜的內(nèi)分泌及代謝變化使其子宮內(nèi)膜容受性下降可能是PCOS患者低妊娠率、高流產(chǎn)率的原因之一[2]。本文以著床窗期的子宮內(nèi)膜為研究對象，給予宮腔灌注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, hCG)，評價子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài)，為PCOS患者的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：研究組：選取新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科2016年04月至2018年04月就診的PCOS患者50例(失訪5例)。納入標準：1)符合2003年鹿特丹標準；2)25～35歲，月經(jīng)周期25～ 35 d；3)無內(nèi)科合并癥，雙側(cè)輸卵管通暢，且無生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變；4)排除男方因素的影響；5)近3個月無宮腔內(nèi)機械操作史。研究組隨機分為研究組1(n=25)及研究組2(n=20)。

對照組：同一時期就診于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科的因男方輕度少弱精癥(mild oligozoospermia)就診的患者25例(失訪2例)，23～35歲。入組標準：基礎內(nèi)分泌正常，近3個月無使用激素類藥物史及宮腔操作史；月經(jīng)周期規(guī)律、雙側(cè)輸卵管通暢、正常排卵；生殖系統(tǒng)無器質(zhì)性病變。

全部研究對象均知情告知并簽署同意書，本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批準文號：(2016)倫審[臨]第(03)號。

1.1.2 試劑：ER和PR單克隆抗體及免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；4%多聚甲醛(上海譜振生物科技有限公司)；2.5%戊二醛(青島捷世康生物科技有限公司)；二甲苯(天津東麗區(qū)天大化學試劑廠)；來曲唑片(江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司)；hCG(麗珠集團麗珠制藥廠)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組：對照組(n=23)為自然周期；研究組1(n=25)、研究組2(n=20)均給予促排卵藥物(月經(jīng)第5～9天口服來曲唑2.5～5 mg qd)，研究組2口服來曲唑同時于排卵前2日及排卵日分別給予hCG 500 IU/mL宮腔灌注1次。

1.2.2 超聲監(jiān)測：從月經(jīng)第10天開始，連續(xù)陰道超聲行子宮內(nèi)膜及卵泡監(jiān)測至排卵(如不排卵則放棄本周期)，排卵后第6～8天為著床窗期。同時根據(jù)卵泡直徑的大小決定宮腔灌注hCG時間。

1.2.3 hCG宮腔灌注：研究組2于排卵前2 d及排卵日分別給予hCG 500 IU/mL(1 000 U/支，用1 mL 0.9%氯化鈉溶液溶解) 宮腔灌注1次。

1.2.4 內(nèi)膜標本收集：各組均于排卵后第6～8天用一次性S型宮腔組織吸引管[浙食藥監(jiān)械(準)字2014第2660911號，產(chǎn)品規(guī)格：TY-C3.1/30-1S]抽取內(nèi)膜組織，將抽取到的子宮內(nèi)膜用0.9%氯化鈉溶液徹底沖洗干凈后，分兩份：一份用4%的多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片和免疫組化染色；另一份投入2.5%戊二醛溶液中固定，用日立掃描電鏡(S-3500N)觀察子宮內(nèi)膜胞飲突的發(fā)育情況。各組均于取內(nèi)膜日抽血檢測血清雌激素(estrogen,E2)和孕激素(progesterone,P)水平。

1.2.5 掃描電鏡觀察：用2.5%戊二醛溶液固定后依次經(jīng)乙醇梯度脫水和叔丁醇干燥，用IB-3噴金離子鍍膜儀噴金處理后在S-3500N日立電子掃描電鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化染色：檢測子宮內(nèi)膜中雌激素受體(estrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)的表達。對固定后的子宮內(nèi)膜標本進行脫蠟、水化，分別加入抗體，脫水、透明、封片后鏡檢。子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞核出現(xiàn)黃褐色顆粒者為陽性表達，每張切片任意取5 個視野，計數(shù)每個視野陽性細胞比率，取平均數(shù)為每張切片的陽性細胞率。

1.2.7 妊娠率計算：各組均于排卵后16 d抽取外周靜脈血3 mL，測定血清hCG值，確定妊娠，計算妊娠率。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

3組研究對象的年齡、不孕年限、內(nèi)膜厚度(排卵日)無差異(表1)。

表1 一般情況的比較Table 1 General condition

2.2 著床窗期血清E2、P的測定

研究組1、研究組2著床窗期E2水平與對照組無差異。與對照組相比，研究組1著床窗期P水平降低(P<0.05)；與研究組1相比，研究組2著床窗期P水平升高(P<0.05)(表2)。

表2 子宮內(nèi)膜著床窗期血清E2、P水平的比較

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with the study group 1.

2.3 免疫組織化學染色

2.3.1 子宮內(nèi)膜中PR表達：PR陽性表達為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞核出現(xiàn)褐色顆粒。對照組、研究組1、研究組2子宮內(nèi)膜上PR陽性表達率分別為38.36%±0.51%、18.63%±0.62%、40.17%±0.53%。與對照組比較，研究組1子宮內(nèi)膜PR陽性表達率減少(P<0.05)，且研究組2子宮內(nèi)膜PR陽性表達率高于研究組1(P<0.05)(圖1)。

2.3.2 子宮內(nèi)膜中ER表達：ER陽性表達為子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞核內(nèi)出現(xiàn)褐色顆粒。對照組、研究組1、研究組2子宮內(nèi)膜上ER陽性表達率分別為38.73%±0.56%、34.26%±0.71%、36.42%±0.63%(圖2)。

2.4 掃描電鏡結(jié)果

發(fā)育中的胞飲突，細胞表面形成光滑、菲薄的內(nèi)膜突起；發(fā)育完全的胞飲突，微絨毛減少，子宮內(nèi)膜表面突起，形如蘑菇；退化的胞飲突，突起減少，微絨毛再次出現(xiàn)，突起物表面褶皺增多，細胞體積增大。

與對照組相比，研究組1成熟期胞飲突的表達率降低(P<0.05)；與研究組1相比，研究組2成熟期胞飲突的表達率升高(P<0.05)(表3,圖3)。

2.5 排卵后16 d各組妊娠情況比較

排卵后16 d研究組1、組2及對照組血清β-hCG陽性總例數(shù)分別為：9、7、9。研究組1總?cè)焉锫?28.0%)明顯低于對照組(39.1%)(P<0.05)；研究組2總?cè)焉锫?45.0%)明顯高于研究組1(P<0.05)。

3 討論

PCOS患者多存在子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育不良，出現(xiàn)子宮內(nèi)膜容受性下降，這可能是導致PCOS患者生育能力低下和高流產(chǎn)率的原因之一[3]。子宮內(nèi)膜容受性又稱“著床窗”，它是內(nèi)膜的一種狀態(tài)，是影響妊娠成功建立的重要因素。胚胎的成功著床取決于胚泡的侵入能力和子宮內(nèi)膜處于最佳容受狀態(tài)[4-5]，電鏡下可見著床窗期的子宮內(nèi)膜上有成熟胞飲突出現(xiàn)，這標志著子宮內(nèi)膜容受性處于最佳狀態(tài)[6]。

圖1 各組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中PR的表達Fig 1 Expression of PR in endometrial stromal cells of each group(immunohistochemically staining, ×400)

圖2 各組子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞中ER的表達

圖3 掃描電鏡下不同時期胞飲突的表現(xiàn)Fig 3 Performance of pinopode in different periods under scanning electron microscopy(×4 000)

表3 成熟期胞飲突的比較Table 3 Comparison of matured pinopode

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with the study group 1.

hCG是胚胎植入過程產(chǎn)生的最為密切的信號分子，在正常的妊娠過程中發(fā)揮廣泛的作用，hCG可以通過延遲子宮內(nèi)膜蛻膜化進程及延長子宮內(nèi)膜著床窗等增加子宮內(nèi)膜容受性[7]。宮腔內(nèi)灌注hCG可以引起子宮內(nèi)膜水平各種生長因子的顯著改變，從而引發(fā)其下游效應而有助于妊娠的發(fā)生[8]。移植前宮腔灌注hCG可以提高胚胎植入率和妊娠率[9]。本研究發(fā)現(xiàn)宮腔灌注hCG可增加成熟期胞飲突數(shù)量，提示hCG對子宮內(nèi)膜胞飲突的形成與成熟有促進作用，可改善PCOS患者的子宮內(nèi)膜容受性。

研究發(fā)現(xiàn)，P水平及子宮內(nèi)膜上PR的表達在一定程度上決定著子宮內(nèi)膜的容受性[10]。排卵后P水平升高，著床窗期PR表達上調(diào)，使子宮內(nèi)膜達到最佳容受狀態(tài)[11]。PCOS患者著床窗期P不足，PR表達降低，使著床窗期延遲出現(xiàn)，胚胎與內(nèi)膜發(fā)育不同步，導致著床率下降[12]。PCOS患者的子宮內(nèi)膜中ER、PR表達下降和缺乏周期性變化可能是胚胎著床障礙的重要原因。本實驗的結(jié)果顯示PCOS患者著床窗期胞飲突的發(fā)育不良可能與P水平、PR表達降低相關(guān)；宮腔灌注hCG可提高P水平及PR表達，使成熟期胞飲突數(shù)量增多，使子宮內(nèi)膜容受性升高，可提高妊娠率。

綜上所述，PCOS患者著床窗期胞飲突發(fā)育不良，宮腔灌注hCG可能使成熟期胞飲突數(shù)量增加，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高妊娠率。著床窗期P水平降低及PR的低表達可能是PCOS患者子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育不良的原因之一，宮腔灌注hCG可升高P水平和增加PR的表達，可能與子宮內(nèi)膜容受性的改善相關(guān)。

志謝：感謝河北醫(yī)科大學電鏡實驗中心對本研究提供的幫助。