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    宮腔灌注人絨毛膜促性腺激素改善多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜容受性

    2020-04-18 08:30:28孫家珍潘瑞洋申素芳

    孫家珍,潘瑞洋,申素芳*

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 1.生殖醫(yī)學(xué)科; 2.心血管內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一種多因性的內(nèi)分泌綜合征,是育齡期女性內(nèi)分泌失調(diào)和排卵性不孕的常見原因之一,影響著女性生育、代謝及心理健康[1]。大量的證據(jù)表明復(fù)雜的內(nèi)分泌及代謝變化使其子宮內(nèi)膜容受性下降可能是PCOS患者低妊娠率、高流產(chǎn)率的原因之一[2]。本文以著床窗期的子宮內(nèi)膜為研究對象,給予宮腔灌注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, hCG),評價子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài),為PCOS患者的治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 研究對象:研究組:選取新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科2016年04月至2018年04月就診的PCOS患者50例(失訪5例)。納入標(biāo)準(zhǔn):1)符合2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn);2)25~35歲,月經(jīng)周期25~ 35 d;3)無內(nèi)科合并癥,雙側(cè)輸卵管通暢,且無生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變;4)排除男方因素的影響;5)近3個月無宮腔內(nèi)機械操作史。研究組隨機分為研究組1(n=25)及研究組2(n=20)。

    對照組:同一時期就診于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科的因男方輕度少弱精癥(mild oligozoospermia)就診的患者25例(失訪2例),23~35歲。入組標(biāo)準(zhǔn):基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常,近3個月無使用激素類藥物史及宮腔操作史;月經(jīng)周期規(guī)律、雙側(cè)輸卵管通暢、正常排卵;生殖系統(tǒng)無器質(zhì)性病變。

    全部研究對象均知情告知并簽署同意書,本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)文號:(2016)倫審[臨]第(03)號。

    1.1.2 試劑:ER和PR單克隆抗體及免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);4%多聚甲醛(上海譜振生物科技有限公司);2.5%戊二醛(青島捷世康生物科技有限公司);二甲苯(天津東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠);來曲唑片(江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司);hCG(麗珠集團麗珠制藥廠)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 分組:對照組(n=23)為自然周期;研究組1(n=25)、研究組2(n=20)均給予促排卵藥物(月經(jīng)第5~9天口服來曲唑2.5~5 mg qd),研究組2口服來曲唑同時于排卵前2日及排卵日分別給予hCG 500 IU/mL宮腔灌注1次。

    1.2.2 超聲監(jiān)測:從月經(jīng)第10天開始,連續(xù)陰道超聲行子宮內(nèi)膜及卵泡監(jiān)測至排卵(如不排卵則放棄本周期),排卵后第6~8天為著床窗期。同時根據(jù)卵泡直徑的大小決定宮腔灌注hCG時間。

    1.2.3 hCG宮腔灌注:研究組2于排卵前2 d及排卵日分別給予hCG 500 IU/mL(1 000 U/支,用1 mL 0.9%氯化鈉溶液溶解) 宮腔灌注1次。

    1.2.4 內(nèi)膜標(biāo)本收集:各組均于排卵后第6~8天用一次性S型宮腔組織吸引管[浙食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2660911號,產(chǎn)品規(guī)格:TY-C3.1/30-1S]抽取內(nèi)膜組織,將抽取到的子宮內(nèi)膜用0.9%氯化鈉溶液徹底沖洗干凈后,分兩份:一份用4%的多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋、切片和免疫組化染色;另一份投入2.5%戊二醛溶液中固定,用日立掃描電鏡(S-3500N)觀察子宮內(nèi)膜胞飲突的發(fā)育情況。各組均于取內(nèi)膜日抽血檢測血清雌激素(estrogen,E2)和孕激素(progesterone,P)水平。

    1.2.5 掃描電鏡觀察:用2.5%戊二醛溶液固定后依次經(jīng)乙醇梯度脫水和叔丁醇干燥,用IB-3噴金離子鍍膜儀噴金處理后在S-3500N日立電子掃描電鏡下觀察。

    1.2.6 免疫組化染色:檢測子宮內(nèi)膜中雌激素受體(estrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)的表達。對固定后的子宮內(nèi)膜標(biāo)本進行脫蠟、水化,分別加入抗體,脫水、透明、封片后鏡檢。子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞核出現(xiàn)黃褐色顆粒者為陽性表達,每張切片任意取5 個視野,計數(shù)每個視野陽性細胞比率,取平均數(shù)為每張切片的陽性細胞率。

    1.2.7 妊娠率計算:各組均于排卵后16 d抽取外周靜脈血3 mL,測定血清hCG值,確定妊娠,計算妊娠率。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況比較

    3組研究對象的年齡、不孕年限、內(nèi)膜厚度(排卵日)無差異(表1)。

    表1 一般情況的比較Table 1 General condition

    2.2 著床窗期血清E2、P的測定

    研究組1、研究組2著床窗期E2水平與對照組無差異。與對照組相比,研究組1著床窗期P水平降低(P<0.05);與研究組1相比,研究組2著床窗期P水平升高(P<0.05)(表2)。

    表2 子宮內(nèi)膜著床窗期血清E2、P水平的比較

    *P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with the study group 1.

    2.3 免疫組織化學(xué)染色

    2.3.1 子宮內(nèi)膜中PR表達:PR陽性表達為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞核出現(xiàn)褐色顆粒。對照組、研究組1、研究組2子宮內(nèi)膜上PR陽性表達率分別為38.36%±0.51%、18.63%±0.62%、40.17%±0.53%。與對照組比較,研究組1子宮內(nèi)膜PR陽性表達率減少(P<0.05),且研究組2子宮內(nèi)膜PR陽性表達率高于研究組1(P<0.05)(圖1)。

    2.3.2 子宮內(nèi)膜中ER表達:ER陽性表達為子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞核內(nèi)出現(xiàn)褐色顆粒。對照組、研究組1、研究組2子宮內(nèi)膜上ER陽性表達率分別為38.73%±0.56%、34.26%±0.71%、36.42%±0.63%(圖2)。

    2.4 掃描電鏡結(jié)果

    發(fā)育中的胞飲突,細胞表面形成光滑、菲薄的內(nèi)膜突起;發(fā)育完全的胞飲突,微絨毛減少,子宮內(nèi)膜表面突起,形如蘑菇;退化的胞飲突,突起減少,微絨毛再次出現(xiàn),突起物表面褶皺增多,細胞體積增大。

    與對照組相比,研究組1成熟期胞飲突的表達率降低(P<0.05);與研究組1相比,研究組2成熟期胞飲突的表達率升高(P<0.05)(表3,圖3)。

    2.5 排卵后16 d各組妊娠情況比較

    排卵后16 d研究組1、組2及對照組血清β-hCG陽性總例數(shù)分別為:9、7、9。研究組1總?cè)焉锫?28.0%)明顯低于對照組(39.1%)(P<0.05);研究組2總?cè)焉锫?45.0%)明顯高于研究組1(P<0.05)。

    3 討論

    PCOS患者多存在子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育不良,出現(xiàn)子宮內(nèi)膜容受性下降,這可能是導(dǎo)致PCOS患者生育能力低下和高流產(chǎn)率的原因之一[3]。子宮內(nèi)膜容受性又稱“著床窗”,它是內(nèi)膜的一種狀態(tài),是影響妊娠成功建立的重要因素。胚胎的成功著床取決于胚泡的侵入能力和子宮內(nèi)膜處于最佳容受狀態(tài)[4-5],電鏡下可見著床窗期的子宮內(nèi)膜上有成熟胞飲突出現(xiàn),這標(biāo)志著子宮內(nèi)膜容受性處于最佳狀態(tài)[6]。

    圖1 各組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中PR的表達Fig 1 Expression of PR in endometrial stromal cells of each group(immunohistochemically staining, ×400)

    圖2 各組子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞中ER的表達

    圖3 掃描電鏡下不同時期胞飲突的表現(xiàn)Fig 3 Performance of pinopode in different periods under scanning electron microscopy(×4 000)

    表3 成熟期胞飲突的比較Table 3 Comparison of matured pinopode

    *P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with the study group 1.

    hCG是胚胎植入過程產(chǎn)生的最為密切的信號分子,在正常的妊娠過程中發(fā)揮廣泛的作用,hCG可以通過延遲子宮內(nèi)膜蛻膜化進程及延長子宮內(nèi)膜著床窗等增加子宮內(nèi)膜容受性[7]。宮腔內(nèi)灌注hCG可以引起子宮內(nèi)膜水平各種生長因子的顯著改變,從而引發(fā)其下游效應(yīng)而有助于妊娠的發(fā)生[8]。移植前宮腔灌注hCG可以提高胚胎植入率和妊娠率[9]。本研究發(fā)現(xiàn)宮腔灌注hCG可增加成熟期胞飲突數(shù)量,提示hCG對子宮內(nèi)膜胞飲突的形成與成熟有促進作用,可改善PCOS患者的子宮內(nèi)膜容受性。

    研究發(fā)現(xiàn),P水平及子宮內(nèi)膜上PR的表達在一定程度上決定著子宮內(nèi)膜的容受性[10]。排卵后P水平升高,著床窗期PR表達上調(diào),使子宮內(nèi)膜達到最佳容受狀態(tài)[11]。PCOS患者著床窗期P不足,PR表達降低,使著床窗期延遲出現(xiàn),胚胎與內(nèi)膜發(fā)育不同步,導(dǎo)致著床率下降[12]。PCOS患者的子宮內(nèi)膜中ER、PR表達下降和缺乏周期性變化可能是胚胎著床障礙的重要原因。本實驗的結(jié)果顯示PCOS患者著床窗期胞飲突的發(fā)育不良可能與P水平、PR表達降低相關(guān);宮腔灌注hCG可提高P水平及PR表達,使成熟期胞飲突數(shù)量增多,使子宮內(nèi)膜容受性升高,可提高妊娠率。

    綜上所述,PCOS患者著床窗期胞飲突發(fā)育不良,宮腔灌注hCG可能使成熟期胞飲突數(shù)量增加,改善子宮內(nèi)膜容受性,提高妊娠率。著床窗期P水平降低及PR的低表達可能是PCOS患者子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育不良的原因之一,宮腔灌注hCG可升高P水平和增加PR的表達,可能與子宮內(nèi)膜容受性的改善相關(guān)。

    志謝:感謝河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實驗中心對本研究提供的幫助。

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