Usher綜合征1型家系PCDH15基因的突變分析與產(chǎn)前診斷

李亞娟，孟繁杰，羅麗雙，于月新，郝冬梅

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，沈陽(yáng) 110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110016）

耳聾的病因復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。據(jù)報(bào)道，50%～60%的先天性耳聾與遺傳因素有關(guān)［1］。在遺傳性耳聾中，以耳聾為唯一癥狀的非綜合征型耳聾約占70%，合并其他癥狀的綜合征型耳聾約占30%［2］。Usher綜合征（Usher syndrome，USH）是以先天性耳聾，視網(wǎng)膜色素變性，伴或不伴前庭功能障礙為特征的常染色體隱性遺傳疾病［3］。發(fā)病率為3.5/100 000～6.2/100 000［4］。Usher綜合征的基因型和表型具有臨床異質(zhì)性，分為USH1，USH2和USH3 3種臨床類型［5］。目前與USH1明確有關(guān)的基因有5個(gè)：MYO7A（USH1B）、USH1C（USH1C）、CDH23（USH1D）、PCDH15（USH1F）和USH1G（USH1G）［6］。

本研究應(yīng)用目標(biāo)基因捕獲和高通量測(cè)序技術(shù)快速高效地檢測(cè)出一個(gè)先天性耳聾家系的致病基因PCDH15，發(fā)現(xiàn)2個(gè)新突變位點(diǎn)，確診先證者為USH1，并針對(duì)PCDH15基因突變?yōu)橄茸C者母親進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

先證者，男，8歲，足月出生，先天性耳聾，出生后抬頭、翻身、坐、爬及行走等運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，19個(gè)月學(xué)會(huì)走路，明顯落后于同齡幼兒，且平衡能力差，行走過程中經(jīng)常跌倒。經(jīng)過長(zhǎng)期的平衡鍛煉后很少跌倒；2歲時(shí)行人工耳蝸植入獲得聽力，目前語(yǔ)言溝通能力良好；2.5歲發(fā)現(xiàn)視力異常，經(jīng)外院檢查為弱視和散光。先證者父母表型正常，非近親結(jié)婚，無家族遺傳病史。先證者母親再次懷孕，于孕18周進(jìn)行產(chǎn)前胎兒基因診斷。本研究經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（原中國(guó)人民解放軍第202醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，先證者父母簽署知情同意書。患者家系圖見圖1。

1.2 方法

1.2.1 樣本獲取和DNA提取：采集先證者和父母全血2 mL，EDTA抗凝，應(yīng)用CWBIO BloodGen Midi Kit試劑盒提取DNA。先證者母親于孕18周在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹取羊水10 mL，應(yīng)用TIANGEN微量樣本基因組DNA提取試劑盒提取胎兒DNA。

圖1 Usher1綜合征家系圖Fig.1 Pedigree map of a family presenting congenital deafness

1.2.2 目標(biāo)基因捕獲和高通量測(cè)序：制備先證者DNA文庫(kù)，采用美國(guó)IDT公司的 xGen Exome Research Panel v1.0捕獲探針對(duì)耳聾相關(guān)基因全外顯子和相鄰內(nèi)含子（50 bp）區(qū)域進(jìn)行捕獲和富集，使用高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina hiseq X10）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)采用the Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件與UCSC hg19人類參考序列進(jìn)行比對(duì)和鑒別遺傳變異，注釋信息包括堿基和氨基酸的保守性，生物學(xué)功能預(yù)測(cè)，正常人群分布頻率數(shù)據(jù)庫(kù)（DYDF、dbSNP、千人基因組、千人南方、千人北方和EXAC），人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD、OMIM和Clinvar）。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增：針對(duì)高通量測(cè)序篩選出的PCDH15基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)上下游測(cè)序引物（表1）。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系為50 μL。

1.2.4 Sanger測(cè)序驗(yàn)證：針對(duì)PCDH15基因突變位點(diǎn)，使用美國(guó)ABI 3730XL測(cè)序儀對(duì)先證者和父母進(jìn)行Sanger測(cè)序，采用DNASTAR軟件與參考序列（NM_001142771）進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.5 致病性預(yù)測(cè)：從美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）變異解讀規(guī)則、遺傳方式及臨床特征吻合度三方面分析篩選變異位點(diǎn)，三方面都符合的突變判定為致病基因。

1.2.6 胎兒產(chǎn)前診斷：確定致病基因突變位點(diǎn)及來源后，利用上述測(cè)序引物及PCR反應(yīng)條件，通過Sanger測(cè)序?qū)μ貉蛩瓺NA進(jìn)行針對(duì)性突變檢測(cè)，確認(rèn)胎兒是否攜帶PCDH15基因突變。

表1 PCDH15基因驗(yàn)證位點(diǎn)的引物序列Tab.1 Primer sequence of PCDH15 gene verification site

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)基因捕獲和高通量測(cè)序結(jié)果

檢測(cè)耳聾相關(guān)基因302個(gè)，測(cè)序量7 133 M，平均測(cè)序深度120.93%，覆蓋度99.95%，20×以上覆蓋度99.29%。結(jié)果顯示，先證者攜帶PCDH15基因第31號(hào)外顯子c.4115delG（p.G1372Efs*4）和第27號(hào)外顯子c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復(fù)合雜合突變。

2.2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

先證者攜帶PCDH15基因第31號(hào)外顯子c.4115 delG（p.G1372Efs*4）和第27號(hào)外顯子c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復(fù)合雜合突變；先證者父親攜帶c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）雜合性突變，母親攜帶c.4115delG（p.G1372Efs*4）雜合性突變。先證者的基因突變分別來源于父親和母親，該家系符合常染色體隱性遺傳，見圖2。

2.3 突變致病性分析結(jié)果

根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南，c.3490_3491insA和c.4115delG為移碼突變，屬于功能缺失型突變，是極強(qiáng)的致病證據(jù)。PCDH15基因是已知的USH1致病基因，與先證者臨床表型和遺傳方式高度吻合。因此，先證者診斷為USH1，PCDH15基因的復(fù)合雜合突變?yōu)樵摷蚁迪忍煨远@的致病基因。

檢索正常人數(shù)據(jù)庫(kù)（DYDF，dbSNP、千人基因組、千人南方、千人北方和EXAC），c.4115delG未見收錄，c.3490_3491insA（rs746865307）頻率為0.000 23（EXAC）；檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD，OMIM和Clinvar）2種突變都未見報(bào)道。c.4115delG和c.3490_3491insA是PCDH15基因新的致病突變位點(diǎn)。

2.4 胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果

羊水DNA中檢測(cè)到胎兒攜帶PCDH15基因c.4115 delG（p.G1372Efs*4）和c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復(fù)合雜合突變，與先證者基因型相同，見圖2。

3 討論

USH1在3種臨床類型中是最嚴(yán)重的，以先天性雙側(cè)感音性神經(jīng)耳聾，持續(xù)的前庭功能障礙和青春期前色素性視網(wǎng)膜炎為特征［7］。USH1患者前庭功能障礙臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，患兒難以獨(dú)立坐穩(wěn)，需他人幫助，于生后9～11個(gè)月可以獨(dú)坐，往往到18個(gè)月后才會(huì)走路［8-9］。本研究中，先證者先天性耳聾，各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)發(fā)育指標(biāo)落后，尤以會(huì)走路時(shí)間晚為顯著特征，并有視力異常，其臨床表型特征高度符合USH1臨床類型。

圖2 PCDH15基因Sanger測(cè)序結(jié)果和PCDH15蛋白功能結(jié)構(gòu)域Fig.2 Sanger sequencing of PCDH15 gene and the conserved domains of PCDH15

人類PCDH15基因編碼原鈣黏蛋白-15，含39個(gè)外顯子，1 955個(gè)氨基酸，包括胞外結(jié)構(gòu)域（多達(dá)11個(gè)胞外鈣黏蛋白重復(fù)序列），1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（CD1、CD2或CD3）［10-11］。原鈣黏蛋白-15屬于鈣依賴性細(xì)胞黏附分子鈣黏著蛋白超家族［12］，免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示其定位于內(nèi)耳毛細(xì)胞纖毛束和視網(wǎng)膜光感受器上［13］。聽覺和平衡覺依賴于內(nèi)耳毛細(xì)胞功能，位于毛細(xì)胞頂端的靜纖毛間的頂連接通過聲波和頭部運(yùn)動(dòng)傳遞機(jī)械力，將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，從而打開毛細(xì)胞的機(jī)械電傳導(dǎo)通道。頂連接是由原鈣黏蛋白-15和鈣黏蛋白-23形成的細(xì)絲，PCDH15基因突變影響其相互作用，導(dǎo)致隱性形式的耳聾［14］。最新研究［15］發(fā)現(xiàn)原鈣黏蛋白15具有順式同源二聚體結(jié)構(gòu)，是毛細(xì)胞感知機(jī)械刺激的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，PCDH15基因突變使其在毛細(xì)胞中的功能受到干擾。PCDH15基因錯(cuò)義突變導(dǎo)致非綜合征性耳聾［10］，而許多更嚴(yán)重的突變（移碼、無義、剪接、大片段缺失）則引起綜合征性耳聾，表現(xiàn)為聽力和前庭功能受損等。PCDH15基因突變都是分散的，沒有突變熱點(diǎn)［16］。

通過NCBI在線生物信息學(xué)分析軟件識(shí)別PCDH15蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，先證者攜帶的PCDH15基因c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12），由于1 bp的插入導(dǎo)致該蛋白第1 164位甲硫氨酸（M）突變?yōu)樘於０罚∟），繼續(xù)翻譯12個(gè)氨基酸序列后出現(xiàn)終止密碼子，蛋白翻譯提前終止，形成截短蛋白，失去部分鈣黏蛋白重復(fù)序列，該蛋白1 164位后的結(jié)構(gòu)域在真核生物高度保守，具有重要功能，該突變導(dǎo)致蛋白功能的失活具有致病性。c.4115delG（p.G1372Efs*4）由于1 bp的缺失導(dǎo)致該蛋白第1 372位甘氨酸（G）突變?yōu)楣劝彼幔‥），在1 375位提前終止翻譯，形成截短蛋白，丟失第1 375位后500多個(gè)氨基酸殘基，也可導(dǎo)致蛋白功能失活具有致病性。PCDH15基因的2個(gè)移碼突變可引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，或者截短蛋白通過無義RNA介導(dǎo)的mRNA衰變途徑被降解，從而使內(nèi)耳毛細(xì)胞的頂連接失去功能，導(dǎo)致先證者耳聾的發(fā)生。

確定耳聾基因致病突變后，提取胎兒羊水DNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶c.4115delG（p.G1372Efs*4）和c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復(fù)合雜合突變，推測(cè)胎兒出生后會(huì)出現(xiàn)與先證者相同的表型，先證者母親知情選擇終止妊娠。

綜上所述，本研究檢出2個(gè)新的致病突變位點(diǎn)c.4115delG和c.3490_3491insA，豐富了PCDH15基因的突變譜。確診先證者為USH1，并針對(duì)PCDH15基因突變?yōu)橄茸C者母親進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，為患病家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了依據(jù)。