基于SSR分子標記的糯玉米遺傳多樣性研究

楊亞桐　董安憶　劉松濤　Zenda Tinashe　段會軍

摘要：為明確糯玉米自交系間的親緣關系，利用19對簡單重復序列（SSR）標記對32份糯玉米自交系進行遺傳多樣性分析，共檢測到80個等位基因變異，每個位點可檢測到2～7個等位基因變異，平均每個位點檢測到4.21個。通過NTSYS聚類分析方法，在遺傳相似系數(shù)為0.53處將32份糯玉米自交系劃分為6個類群，分別包含3份、2份、11份、11份、2份和3份，其中親緣關系較近的白糯6和突變體N17聚在了一起，3個雜交種（鄭黃糯2號、石彩糯和京科糯）的父母本被劃分在不同的類群中，進一步從分子水平上揭示了親本種質(zhì)的遺傳差異與玉米雜種優(yōu)勢的關系，為玉米育種和改良奠定了理論基礎。

關鍵詞：糯玉米;SSR;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號： S513.032

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0083-04

收稿日期：2019-01-14

作者簡介：楊亞桐（1994—），男，河北河間人，碩士研究生，主要從事作物遺傳資源與利用研究。E-mail：1539245869@qq.com。

通信作者：段會軍，博士，教授，主要從事作物遺傳資源與利用研究。E-mail：hjduan@hebau.edu.cn。

糯玉米（Zea mays L. var. ceratina Kulesh）是玉米屬的一個亞種[1]，是普通玉米第9染色體短臂上的Wx基因發(fā)生隱性突變形成的一種蒸煮后呈糯性的突變體[2-3]，由于糯玉米籽粒干燥后胚乳呈角質(zhì)不透明、無光澤的蠟質(zhì)狀，所以又被稱作蠟質(zhì)玉米[4]。根據(jù)糯玉米籽粒的顏色可以分為：白糯、黃糯、紫糯、黑糯以及彩糯等，其中白糯和黃糯較為常見[5]。糯玉米具有富含支鏈淀粉[6]、營養(yǎng)豐富和適口性良好等優(yōu)良特性，現(xiàn)已成為深受人們歡迎的食品和工業(yè)原料，具有較高的經(jīng)濟價值。

SSR（simple sequence repeats，簡單重復序列）又稱為微衛(wèi)星DNA[7]，是共顯性分子標記，是建立在PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應）基礎之上的一種遺傳標記，具有很高的多態(tài)性和覆蓋率，測得結果的穩(wěn)定性和重復性比較好，試驗操作程序簡單，對DNA的數(shù)量和純度要求較低[8]。國內(nèi)外研究學者在玉米遺傳多樣性方面做了大量的研究工作，李銳等利用SSR技術對來源于144份甜玉米群體的40個位點進行了分析，共檢測到343個等位變異，每對引物測出4-17個等位變異，平均8.58個，SSR聚類分析將144份甜玉米群體劃為7個類群[9];谷靜叢利用28對SSR引物對110份普通玉米自交系進行遺傳多樣性分析，將其劃分為六大類群，19個亞類群[10];Warburton等[11]、Reif等[12]的研究結果證實了利用SSR標記進行玉米遺傳多樣性及雜種優(yōu)勢群劃分的可行性。

盡管SSR分子標記較普遍地應用于植物的遺傳多樣性研究上，但在糯玉米種質(zhì)資源中的研究報道比較少。本研究利用SSR分子標記對32份糯玉米自交系進行遺傳多樣性分析，確定供試糯玉米自交系間的遺傳背景差異，為糯玉米優(yōu)良品種選育和雜種優(yōu)勢模式構建提供研究基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選自河北農(nóng)業(yè)大學鮮食玉米課題組選育的26份糯玉米自交系，編號為N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11、N12、N13、N14、N15、N16、N17（白糯6突變體）、N18、N19（石白糯1號）、N20、N21、N22、N23、N24、N25、N26和引進的國審糯玉米品種鄭黃糯2號父母本（鄭黃糯04、鄭黃糯03）、石彩糯父母本（石糯1號、石糯2號）及京科糯父母本（白糯6、京糯6）。

1.2 方法

1.2.1 用CTAB法提取玉米葉片基因組DNA 將玉米種子浸泡1夜，播種（每個品種播3粒）;待玉米長到3～4葉時取葉提取玉米基因組DNA。具體提取步驟：（1）將無水乙醇放入-20 ℃冰箱中預冷，CTAB放入65 ℃水浴鍋中預熱1 h。（2）取新鮮玉米葉片加入適量已預熱好的CTAB中研磨，分別裝入1.5 mL離心管中，放入65 ℃水浴鍋中水浴60～75 min。（3）從水浴鍋中取出，加入等體積的氯仿異戊醇（24 ∶1）。使用搖床搖晃或用手上下翻轉(zhuǎn) 20 min。（4）放入離心機中，10 000 r/min離心 10 min。（5）取上清液至新離心管中，加入等體積氯仿異戊醇，搖晃15 min。放入離心機中，10 000 r/min離心10 min。（6）取上清液至新的離心管中，加入 -20 ℃ 預冷好的無水乙醇至1.5 mL，緩緩搖晃，出現(xiàn)白色絮狀沉淀（DNA），放入冰箱-20 ℃中冷卻 5 min。（7）從冰箱中取出DNA，放入離心機中離心，10 000 r/min，10 min，棄上清液。（8）加入75%乙醇（75 mL 95%乙醇+20 mL蒸餾水）70 μL，將DNA彈起，搖晃10 min，充分洗滌DNA，放入離心機中 10 000 r/min離心2～3 min。棄上清，共洗脫3次。（9）將洗脫好的DNA開蓋晾干，晾1夜即可，第2天可加去離子水溶解（100 μL）。（10）測量DNA濃度（放-20 ℃冰箱中保存）。

1.2.2 SSR引物 選用19對SSR引物（表1），由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR反應 20 μL PCR反應體系如下：cDNA 2.0 μL;Buffer 2.0 μL;上下游引物各1.0 μL;Taq DNA Polymerase 0.2 μL;dNTP 1.6 μL;ddH2O 12.2 μL。體系混合均勻后加1小滴礦物油（全過程在冰上進行）。

PCR程序為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性 40 s，X ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。10 ℃保溫。注意X ℃退火，具體退火溫度參考引物Tm值;擴增完成后，放入冰箱4 ℃保存。

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