豬偽狂犬病病毒變異株在國內(nèi)的研究進展

徐寧，欒美慧，郜艷雪，葛桂陽，李東麗，劉藝，宮慶龍，冷雪*，杜銳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118；3.教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室/吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林 長春 130118)

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，該病作為自然疫源性疾病，可感染包括豬牛羊在內(nèi)的40多種家畜、家禽、野生動物等，但是豬是唯一能夠在急性原發(fā)感染中存活并且表現(xiàn)出亞臨床癥狀和潛伏感染特性的宿主，不同年齡段的豬均可感染PRV并表現(xiàn)出不同的臨床癥狀：幼豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，即嘔吐、搔癢、顫抖、癱瘓、腹瀉等，并可能死于嚴重的腦脊髓炎；懷孕的母豬感染PRV會導致胎兒流產(chǎn)或死亡[1]；成年豬則會出現(xiàn)發(fā)熱和呼吸道癥狀，且呈潛伏感染狀態(tài)，即耐過后長期帶毒排毒[2]繼而成為隱蔽傳染源，這一感染特性嚴重阻礙了偽狂犬病的防治及根除。

傳統(tǒng)的Bartha-k61株疫苗因具備良好的免疫效果而被廣泛使用，但是近年來PRV變異較為明顯，導致傳統(tǒng)疫苗的保護效果大幅度降低，自2011年開始，豬偽狂犬病再次在Bartha-k61株疫苗免疫過的豬場發(fā)生[3]，相比于傳統(tǒng)PRV毒株，PRV流行變異株致病力明顯增強，感染豬表現(xiàn)出更明顯的臨床癥狀和病理變化，發(fā)病率和死亡率也明顯增高，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

1 PRV的特征

PRV屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，是一種具有泛嗜性、嗜神經(jīng)性和潛伏感染等特性的病毒。

1.1 理化特征

PRV粒子在形狀上呈球形，未成熟的病毒粒子直徑約在120～150 nm之間，帶包膜的成熟的病毒粒子直徑約在150～180 nm之間。在結(jié)構(gòu)上從內(nèi)到外共分為4層，分別為雙鏈DNA病毒核心、二十面體核衣殼、包含蛋白質(zhì)的皮層以及被囊膜蛋白包圍的外膜層[4]。因此PRV對有機溶劑乙醚、氯仿等極度敏感[5]，經(jīng)5%苯酚處理2 min或接觸0.5%～1%氫氧化鈉就可使其迅速滅活；但PRV對熱耐受，完全滅活PRV需55～60 ℃持續(xù)30～50 min，80 ℃持續(xù)3 min，100 ℃持續(xù)1 min。

1.2 基因組特征

PRV是雙鏈線性DNA病毒，基因組全長約為143 kb，全基因組由4部分構(gòu)成，分別為獨特長區(qū)段(UL)、短區(qū)段(US)、內(nèi)部重復區(qū)段(IR)和末端重復序列(TR)[6-7]。目前對于UL區(qū)段的研究較為深入，PRV病毒的基因組通過滾環(huán)復制進行擴增，位于UL區(qū)段的某些基因以一定的方式調(diào)控病毒的復制，其中UL5、UL8、UL9、UL42與UL52等基因的轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)物均參與其復制過程[8]，除此之外，UL區(qū)段還分布著多個毒力基因，如gB(UL27)、gC(UL44)、gM(UL10)及TK(UL23)基因，這些基因與US區(qū)段的gD(UL6)、gI(US7)、gE(US8)基因共同決定病毒毒力。

2 PRV變異株流行情況

由于豬偽狂犬病具有潛伏感染，高致病性，高死亡率等特性，在很大程度上限制了我國豬場集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，該病一直是研究熱點之一。多年來我國通過免疫接種，野毒監(jiān)測及凈化等技術(shù)手段，已經(jīng)使疫情得到有效控制。但是自2011年起，豬偽狂犬病再次在我國河北和山東等養(yǎng)殖密度較大的華北地區(qū)暴發(fā)流行，隨后疫情蔓延至我國中東部十余個省(市)，至2014年已蔓延至全國[9]，許多規(guī)模化的豬場都不同程度上出現(xiàn)了傳統(tǒng)疫苗免疫失敗的情況，具體表現(xiàn)為接種過傳統(tǒng)疫苗的豬群再次表現(xiàn)出疑似豬偽狂犬病的臨床癥狀，感染豬的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢。經(jīng)相關(guān)毒力基因測序表明新的PRV變異株抗原性已發(fā)生一定變異，分屬于一個相對獨立的分支，傳統(tǒng)的PRV毒株屬于基因Ⅰ型，而變異株屬于基因Ⅱ型。相比于經(jīng)典強毒株，PRV變異株引起的臨床癥狀更明顯，傳播速度更快，致死率更高，呈現(xiàn)出毒力增強的趨勢[10]。

3 PRV變異株主要毒力基因及其遺傳變異

3.1 TK基因

TK基因位于UL區(qū)，長約963 bp，共編碼320個氨基酸。TK基因雖然是PRV體外復制的非必需基因[11]，但卻是PRV最主要的毒力決定因子，其編碼蛋白對PRV的毒力影響最大。因此TK基因常作為缺失致弱疫苗的主要靶基因[12]。同時，TK基因還以一定的方式調(diào)控PRV的潛伏感染及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的增殖過程，在很大程度上決定病毒的長期感染性和嗜神經(jīng)性。

由于存在保守序列，TK基因具有嚴格的保守性。黃藝珠等[13]從山東省某發(fā)病豬場分離鑒定得到PRV變異株并命名為SD株，將其 TK基因與國內(nèi)外8個PRV毒株TK基因序列相比較，結(jié)果顯示SD株與匈牙利的 Bartha 株、Kaplan 株及韓國的 Yangsan 株相比核苷酸和氨基酸序列同源性分別為 99.4%～99.7%和99.7%，與國內(nèi)其他毒株相比核苷酸和氨基酸同源性分別為99.1%～99.5%和97.6%～98.8%，與國外毒株同源性較高，說明SD 株可能是由國外毒株變異而來；王琳等[14]對河南省PRV變異株冀A株TK基因序列分析結(jié)果表明，冀 A 株 TK 基因與 GenBank 中收錄的國內(nèi)外其他PRV毒株TK基因同源性都在99%以上，且都具有共同的保守序列R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P *AR-，該結(jié)論與王勤等[15]報道的PRV TK、gD基因具有高度保守性的結(jié)果相吻合，與參考毒株相比，冀A株TK基因編碼的氨基酸存在丙氨酸(Ala)284→纈氨酸(Val)284變異，該突變?yōu)榧紸株所特有。

3.2 gI基因

gI基因位于US區(qū)，長約1 050 bp，共編碼349個氨基酸，是PRV的重要毒力基因。gI基因編碼蛋白不僅可在細胞水平發(fā)揮其毒力作用，還可促進病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的增殖，從而影響其神經(jīng)嗜性。

肖少波等[16]研究發(fā)現(xiàn)單獨缺失gI或gC基因均可使PRV毒力下降，但雙缺失gI和gC基因的重組病毒毒力會大幅下降甚至完全喪失，由此得出結(jié)論gI基因可促進或協(xié)同其他毒力蛋白發(fā)揮毒力作用。研究表明在病毒侵染過程中，gI基因通過促進病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的復制過程從而影響病毒的神經(jīng)嗜性[17]。缺失gI基因的PRV雖然可以和野生型PRV一樣沿著神經(jīng)元侵入到神經(jīng)系統(tǒng)中，但相比于野毒來說，gI基因缺失株感染的神經(jīng)元數(shù)量顯著降低。有報道稱gI基因編碼蛋白在172位缺失1個氨基酸及在238位插入1個氨基酸是PRV突變株的顯著特征，林群群等[18]對PRV變異株(NP株)gI基因進行同源性比對分析，結(jié)果顯示NP株與國外分離株(75V19株、NS374株、Becker株、Kaplan株)相比氨基酸同源性為89.9%～92.3%，與國內(nèi)PRV分離株(BJ-YT株、Xiang A株、Ea株)相比氨基酸同源性為99.2%～99.5%，其中與國內(nèi)PRV分離變異株相比氨基酸突變位點主要集中在第165～173位和第236～246位這2個區(qū)域，與報道中PRV突變株的顯著特征有出入，關(guān)于PRV變異株在gI基因上所體現(xiàn)出的突變規(guī)律還需更多的相關(guān)研究加以歸納總結(jié)。

3.3 gE基因

gE基因位于US區(qū)，前接gI基因，長約1 734 bp，共編碼577個氨基酸。gE基因編碼蛋白具有促進細胞融合的作用，在PRV入侵宿主細胞的過程中，gE糖蛋白通過促進感染細胞與非感染細胞的融合，從而介導病毒在細胞水平傳播而發(fā)揮其毒力作用。此外，gE糖蛋白還與PRV的組織趨向性密切相關(guān)，有助于病毒定向擴散至宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在一定程度上決定PRV的嗜神經(jīng)性[19]。在PR基因缺失疫苗研究中，gE基因常作為缺失致弱的標志基因，臨床上常采用gE-ELISA試劑盒檢測gE基因的有無從而區(qū)分PRV感染類型，即野毒株感染或疫苗株感染。

研究表明gE基因是與其他基因通過共價鍵形成統(tǒng)一體，以復合物的形式發(fā)揮其毒力作用的。Zuckermamna等[20]為了研究gE基因的致病機理，在感染的細胞中運用免疫沉淀法證實gE與gI不但形成gE/gI非共價復合物作為病毒的功能成分，而且可能以一個完整的功能性單位行使其功能，該復合物在促進病毒在細胞間擴散的同時，也涉及病毒從細胞的釋放及細胞融合過程[21]。此外gE/gI還可與其他基因進行互作而行使功能：gE/gI/TK相互作用會使PRV的毒力進一步增強；gE/gI/gC相互作用可主導病毒的釋放[22]。

gE基因在PRV基因組中相對保守，其本身遺傳變異性并不大。覃雨陽等[23]將國內(nèi)外PRV毒株作為參考毒株，對廣西不同地區(qū)流行的4株P(guān)RV變異株gE基因進行同源性比對分析，研究結(jié)果顯示4株P(guān)RV變異株與廣東Fa株、湖北HD株等變異株相比氨基酸和核苷酸同源性分別高達99.8%和99.7%，遠遠高于與國內(nèi)經(jīng)典毒株的同源性，且與變異株廣東Fa株、湖北HD株相比，4株P(guān)RV變異毒株gE基因的48位均存在1個天冬氨酸插入的情況；趙鴻遠等[24]將在吉林和黑龍江發(fā)病豬場分離鑒定得到的2株P(guān)RV變異株分別命名為JL1株、HLJ1株，對2株變異株的gE基因進行同源性比對分析可知，與經(jīng)典毒株相比JL1株、HLJ1株核苷酸同源性為96.6%～99.1%；與變異株相比核苷酸同源性為97.1%～99.5%，與變異株表現(xiàn)出較高的同源性，且變異株均存在gE蛋白48位和492位附近各插入1個天冬氨酸的情況，該研究認為此分子特征可用來鑒定PRV毒株變異與否，但是陳超等[25]調(diào)用GenBank中多株不同來源的PRV參考毒株與山東省12株P(guān)RV流行變異株的gE基因進行序列比對發(fā)現(xiàn)，LDZ04-2014株與2012年分離于國內(nèi)的HBBA2012株的492位并沒有天冬氨酸的插入，而分離于2001年的Fa株、2008年的HNJZ等經(jīng)典毒株的492位卻存在2個天冬氨酸的插入，所以gE基因492位天冬氨酸的插入現(xiàn)象并不是變異株所特有的分子特征，早在經(jīng)典毒株中就存在，因此不能將其作為鑒定PRV毒株是否變異的標準，關(guān)于PRV變異株在gE基因上體現(xiàn)出的生物學特性尚需深入研究。

3.4 gB基因

gB基因位于UL區(qū)，全長約2 742 bp，共編碼913個氨基酸，是PRV的主要毒力基因。gB基因編碼蛋白作為PRV病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，不僅是病毒囊膜的主要成分，還可以誘導機體產(chǎn)生2種中和抗體從而發(fā)生特異性細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，此外糖蛋白gB也與PRV感染宿主密切相關(guān)，在PRV入侵宿主細胞過程中，首先糖蛋白gC介導PRV病毒粒子結(jié)合到宿主細胞表面[26]，調(diào)控有糖蛋白gB參與的PRV膜早期融合過程，gD受體結(jié)合蛋白再與宿主表面的受體蛋白結(jié)合，激發(fā)gB和gH/gL二聚體這一核心融合機器發(fā)揮作用，使PRV病毒粒子與宿主細胞融合從而完成侵染過程。

gB基因是皰疹病毒屬中最保守的糖蛋白基因，在PRV的遺傳變異過程中表現(xiàn)出高度保守性。張新平等[27]以GenBank中收錄的國內(nèi)外具有代表性的PRV分離株作為參考毒株，對福建變異株(LY株)gB基因進行同源性比對分析，結(jié)果顯示LY株與國外參考毒株(Becker株、Bartha株、Kaplan株、SouthKorea株、Japan株)相比氨基酸及核苷酸同源性分別為62.9%～96.4%、74.9%～98.1%；與國內(nèi)流行毒株Ea株(湖北)相比氨基酸及核苷酸同源性分別為95.8%、98.8%，與國內(nèi)流行毒株表現(xiàn)出較高的同源性，表明LY株是由國內(nèi)流行株遺傳變異而來；劉志成等[28]通過對廣東省2015年分離得到的PRV流行變異株(LC株)gB基因進行分析比對可知，LC株與中國經(jīng)典毒株(Ea株、Fa株、SC株)相比氨基酸及核苷酸同源性分別為99.1%～99.3%、99.7%～99.8%；與2012年分離變異株(HNX株、HNB株、HN1201株、HeN1株、JS-2012株、ZJ01株、TJ株、HLJ8株)相比同源性分別為99.8%～99.9%、99.9%～100.0%，證明LC株是在PRV變異株的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。

4 PRV變異株疫苗的研制

疫苗在防控PRV流行的過程中發(fā)揮了重要作用。目前國內(nèi)市場上現(xiàn)有的以經(jīng)典PR毒株為親本的基因缺失疫苗主要包括Bartha-K61株、鄂A株、Hb98株、Hb2000株SA215株等，其中以Bartha-K61株為重要代表，Bartha-K61疫苗株缺失了主要毒力基因gE，為gE基因缺失疫苗結(jié)合gE-ELISA鑒別診斷方法凈化和根除PR提供理論基礎(chǔ)。這些疫苗對我國PR的防控發(fā)揮了巨大的作用。但是自2011年以后，我國部分地區(qū)的豬場免疫過Bartha-K61疫苗的仔豬相繼表現(xiàn)出疑似PR的臨床癥狀，新的PR引發(fā)的疫情再次暴發(fā)流行，并從華北地區(qū)開始蔓延至全國，且臨床采樣結(jié)果顯示PRV野毒檢出率增加。楊濤等[29]將廈門市2017年分離得到的PRV變異株與4個廠家的Bartha-K61活疫苗的免疫原性基因gB、gC、gD進行同源性比對分析，結(jié)果顯示變異株與Bartha-K61疫苗株相比，在gB、gC、gD蛋白序列中均存在不同程度的差異，在其氨基酸序列基礎(chǔ)上建立的進化分析結(jié)果表明，PRV變異株與Bartha-K61分屬于不同進化分支，從而導致Bartha-K61的免疫保護效力不足以抵抗PRV變異株的攻擊。據(jù)報道，Bartha-K61對于PRV新流行變異株引起的疫情免疫失敗的情況在我國多有發(fā)生，新的PR疫情表現(xiàn)為高致病力，高死亡率，流行勢頭迅猛，因此研制新的針對PR流行變異株的疫苗刻不容緩。

目前，針對PRV流行變異株基因缺失疫苗開展了大量研究。童武等[30]運用同源重組的方法構(gòu)建了gE/gI雙基因缺失的JS-2012株，利用該毒株的滅活疫苗接種1次后免疫仔豬對變異毒株JS-2012的保護率達到60%，免疫2次后保護率達到100%；顧真慶等[9]利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了雙基因缺失株vZJ01ΔgE/gI，將該毒株制成滅活疫苗，與Bartha-K61對照組共同進行豬體免疫保護試驗，結(jié)果表明vZJ01ΔgE/gI滅活疫苗可以抵御PRV超強毒株ZJ01株的致死攻擊，且免疫效果優(yōu)于對照組Bartha-K61活疫苗。

基于雙基因缺失的三基因缺失苗具有更好的安全性及免疫原性，基本不會有散毒或毒力返強的情況出現(xiàn)。Cong等[31]利用細菌人工染色體技術(shù)構(gòu)建了gE/gI/TK三基因缺失的HN1201株，對豬群持續(xù)免疫4周后進行攻毒試驗，結(jié)果顯示該缺失株對免疫豬群的保護率高達100%；胡睿鳴等[32]運用基因工程技術(shù)構(gòu)建了gE/gI/TK三基因缺失的 r SMXΔgI/gEΔTK株，該毒株接種1次后免疫仔豬對變異毒株CH/HNSMX/2012的保護率就可達到100%，且易感動物(小鼠、綿羊、新生仔豬等)經(jīng)免疫后并未表現(xiàn)出臨床癥狀，表明該毒株安全性良好。呂素芳等[33]在TK基因缺失的質(zhì)粒pBTK及gI/gE雙基因缺失株P(guān)RV SA738病毒基因組的基礎(chǔ)上，運用脂質(zhì)體介導法構(gòu)建了三基因缺失株gI/gE/TK PRV SA738，利用該毒株制成活疫苗首免仔豬42 d后進行攻毒試驗，結(jié)果表明該三基因缺失株對SA等強毒株的攻擊可提供完全免疫保護，且免疫效果優(yōu)于gE/gI PRV突變株。

諸多臨床實踐證明基因缺失苗可使免疫豬免受PRV變異株的致死性攻擊，可作為有效的候選疫苗，且與傳統(tǒng)毒株疫苗相比基因缺失苗具有致病性小，無潛伏感染，安全高效等優(yōu)勢，在對PR的防控方面具有重要意義。截止目前，由我國國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心研制的豬偽狂犬病滅活疫苗(HN1201-ΔgE株)已于2019年1月取得新獸藥注冊證書。該疫苗株是在PR變異株(HN1201株)作為母本的基礎(chǔ)上缺失gE基因而得到的，對當前PRV流行變異株引發(fā)的豬偽狂犬病具有較好的免疫保護效果，且可通過gE-ELISA診斷試劑盒鑒定PR感染類型。

5 PRV感染的防控

PRV多為潛伏感染，即接種疫苗后的康復畜群雖恢復正常生產(chǎn)，但應(yīng)激后仍會重新激發(fā)隱性感染而表現(xiàn)出臨床癥狀，并長期帶毒散毒而成為二次感染源，這一特點使該病在豬群中長期循環(huán)傳播，嚴重阻礙我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展進程，因此開展豬偽狂犬病防控措施的研究有重要意義。

對于PRV的防控主要應(yīng)從免疫接種，加強飼養(yǎng)管理和消除傳播媒介等幾個方面著手。首先要基于豬場具體的檢疫情況制定合理的免疫程序，通常以豬場陽性率10%作為臨界水平，陽性率高于10%時一般采取密集免疫形式，低于10%時采取一般免疫形式，同時定期對豬群PR陽性率進行監(jiān)測，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時調(diào)整免疫程序，根據(jù)毒株流行情況指導疫苗選擇，對于疑似隱性帶毒豬要制定合理的免疫方案并嚴格按照免疫程序執(zhí)行，同時利用間接ELISA法檢測豬群抗體水平，掌握豬群潛伏感染情況，對于陽性豬，隱性帶毒豬一律采取淘汰，撲殺的處理方式，從源頭上阻斷PRV的感染和傳播。同時加強飼養(yǎng)管理，基于飼養(yǎng)標準針對豬群制定科學合理的飼養(yǎng)方案，滿足機體的營養(yǎng)需求，同時營造干凈衛(wèi)生的飼養(yǎng)環(huán)境，對豬舍進行定期消毒以預(yù)防病原傳播及疫情擴散蔓延，消毒時以2種以上消毒藥物交替使用為宜。消除傳播媒介對于PRV感染的防控同樣重要，規(guī)?；B(yǎng)豬場要構(gòu)建一套適用于豬場自身條件的生物安全體系，根據(jù)豬種類的不同實行分群飼養(yǎng)，對進入豬場的車輛和人員進行嚴格消毒。另外鼠類作為PRV的主要帶毒者和傳播媒介應(yīng)給予高度重視[34]。在做好定期滅鼠工作的同時也要注意飼料保存，避免用于投喂的飼料被鼠代謝物污染。

6 小結(jié)

近年來由于PRV在基因組水平上發(fā)生了新的變異，導致其相比于傳統(tǒng)毒株在抗原性以及毒力方面發(fā)生較大變化，因此傳統(tǒng)疫苗已經(jīng)不能使豬群完全抵御PR的攻擊，研制一種針對當前PRV流行株的新型疫苗就顯得極為迫切和必要。

PRV毒力由多基因共同調(diào)控，致病機理復雜，目前基因缺失疫苗憑借其顯著的優(yōu)勢在控制PR方面表現(xiàn)出了良好的發(fā)展前景。因此，今后PR疫苗發(fā)展的主要方向還是構(gòu)建新的基因缺失株從而發(fā)展雙價或多價疫苗，但致弱PRV在作為構(gòu)建基因缺失苗技術(shù)核心的同時，也引起了一些問題，例如會在一定程度上導致疫苗的保護效果降低等，所以基因缺失疫苗的安全性及免疫效力還需進一步的評價。針對于PRV變異株的疫苗HN1201-ΔgE株疫苗已于2019年獲得新獸藥證書，相信隨著基因缺失手段的成熟及PR防控體系的健全，更多的基因缺失疫苗在不久的將來會應(yīng)用于臨床，為偽狂犬病的區(qū)域性凈化及全國凈化奠定堅實的基礎(chǔ)。