禽流感血凝抑制試驗(yàn)體會(huì)

白 翠，李海燕，鄭 聰，刁鵬翔，王 晉

1.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130062；2.吉林省通化市二道江區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，吉林通化 134000；3.吉林市龍?zhí)秴^(qū)江北鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林吉林市 132000；4.吉林市昌邑區(qū)兩家子鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林吉林市 132000

禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)是禽流感抗體檢測(cè)常用的實(shí)驗(yàn)。免疫抗體的監(jiān)測(cè)工作對(duì)禽流感的防控工作有重要的意義。

1 血凝和血凝抑制的定義

血凝是某種病毒能夠使某種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集的現(xiàn)象。它在血凝抑制試驗(yàn)中，用于4單位抗原的測(cè)定和抗原回歸試驗(yàn)。

血凝抑制是當(dāng)病毒懸液中加入了特異性的抗體，這種抗體的量完全能夠抑制病毒凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象。

2 試驗(yàn)前各種試劑的準(zhǔn)備

2.1 阿氏液和PBS

2.1.1 阿氏液

阿氏液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，也可以提前配好高壓滅菌后備用。

2.1.2 PBS

PBS可以按照試劑說明書或者實(shí)驗(yàn)室存放的指導(dǎo)手冊(cè)自行配置，并進(jìn)行pH的測(cè)量。

為了方便實(shí)用，操作準(zhǔn)確，市場(chǎng)上也有成品的液體，還有配制好的粉末（只需按照說明溶于蒸餾水中即可）。這兩種都建議使用，省去我們各種配置環(huán)節(jié)。對(duì)于成本而言，粉末狀的更便宜些，適合大量操作樣品的實(shí)驗(yàn)室使用。

2.2 1%紅細(xì)胞

為防止溶血和不同個(gè)體雞只對(duì)HI效價(jià)的影響，一般采取3只或3只以上的SPF公雞，采血后不可隨意上下左右搖晃采血管，分離后的血清冷藏保存，一般不要超過24 h。洗滌紅細(xì)胞過程中，要用PBS緩慢吹吸，力度均勻，不可用力過猛。離心的轉(zhuǎn)數(shù)不超過2 000 r/min，轉(zhuǎn)數(shù)過高會(huì)引起溶血現(xiàn)象。

有部分文獻(xiàn)表明，洗滌液PBS要好于生理鹽水，因?yàn)镻BS有對(duì)其它酸堿物質(zhì)緩沖的能力，可以維持反應(yīng)體系的pH值，而生理鹽水不具備這種緩沖的作用。

還有的操作人員，誤把純凈水當(dāng)成洗滌液，造成不必要的結(jié)果，所以我們?cè)谙礈烨耙龊酶鞣N試劑的準(zhǔn)備工作。

3 血凝試驗(yàn)抗體效價(jià)的判定

抗體效價(jià)首先要確定4單位抗原。4單位抗原的配制，是通過血凝試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)的。抗原的效價(jià)是血凝抑制試驗(yàn)中重要的一項(xiàng)，它的準(zhǔn)確度直接影響著最后結(jié)果的判定。測(cè)定效價(jià)時(shí)，可以2人同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)稀釋倍數(shù)都做復(fù)孔。測(cè)定好血凝效價(jià)后，最好要做個(gè)抗原回歸試驗(yàn)，以消除血凝試驗(yàn)中，試驗(yàn)人員和試驗(yàn)操作中的誤差和不足。

4 血凝抑制結(jié)果判定

每個(gè)試驗(yàn)是否成功的標(biāo)準(zhǔn)是看它的陰性和陽(yáng)性血清對(duì)照。所以每次試驗(yàn)都要設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照。在對(duì)照正確的情況下，將反應(yīng)板傾斜，從背面觀察紅細(xì)胞凝集情況，也就是“流淚”狀況。淚滴長(zhǎng)度對(duì)時(shí)間有要求，所以判斷時(shí)間要迅速，當(dāng)陽(yáng)性血清反應(yīng)后，就開始觀察。一般在室溫條件下30～40 min出結(jié)果。

血凝和血凝抑制試驗(yàn)是檢測(cè)禽流感病毒抗體最常用的方法，由于操作簡(jiǎn)單，涉及到的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備又很少，所以被廣為應(yīng)用。但由于它的判斷方式是以肉眼為準(zhǔn)，所以在判斷結(jié)果上是“仁者見仁智者見智”，這是該實(shí)驗(yàn)的誤差所在。我們要熟練掌握該實(shí)驗(yàn)的操作方法，用校準(zhǔn)過的移液器、標(biāo)準(zhǔn)的V底反應(yīng)板、無溶血的紅細(xì)胞和“可信賴”的操作人員，當(dāng)然我們還要用采樣標(biāo)準(zhǔn)的樣品血清，這樣我們的結(jié)果就會(huì)很理想、很清晰。