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    產(chǎn)蛋主要基因?qū)ψ样Z產(chǎn)蛋性能的影響研究

    2020-06-02 07:29:22董嫁詩(shī)劉鼎鑫
    吉林畜牧獸醫(yī) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:感受態(tài)產(chǎn)蛋量產(chǎn)蛋

    李 鵬,董嫁詩(shī),劉鼎鑫

    黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江大慶 163319

    北方寒區(qū)多年來(lái)飼養(yǎng)的地方良種鵝-籽鵝,產(chǎn)于黑龍江綏化和松花江地區(qū),是世界上產(chǎn)蛋量最多的鵝種之一,一般年產(chǎn)蛋可達(dá)14~20 kg[1]。然而,隨著鵝產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展,鵝的需求量逐年增加,但由于鵝繁殖性能較低,限制了鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。據(jù)專(zhuān)家預(yù)測(cè),目前全國(guó)養(yǎng)鵝約6億多只,鵝肉產(chǎn)量70萬(wàn)噸,約為牛羊肉產(chǎn)量的40%;市場(chǎng)缺口在3億只左右。利用分子生物學(xué)技術(shù)提高禽類(lèi)繁殖性能的研究發(fā)展很快,在雞的研究方面尤為突出,國(guó)內(nèi)外均取得了較多的科研成果[3]。本研究針對(duì)影響籽鵝產(chǎn)蛋性能的主要基因即促卵泡素(FSH)、催乳素(PRL)、抑制素(INH)開(kāi)展研究,以提高籽鵝的繁殖性能,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品

    選擇本地健康成年雌性籽鵝2只,取籽鵝卵泡及腦垂體。

    1.1.2 所需試劑

    pMD18T載體(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司);pcDNA3.0、pET-32a載體(由本實(shí)驗(yàn)室保存);RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司);限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司);T4DNA 連接酶(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司);其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

    1.1.3 主要儀器

    Pico-21型臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher生產(chǎn));DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠生產(chǎn));凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP生產(chǎn));T100TM型PCR儀(美國(guó)BIO-RAD生產(chǎn));LDZX-50KBS型高壓滅菌器(艾科儀器生產(chǎn));DRP-9272型培養(yǎng)箱(上海培因試驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn));超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司生產(chǎn))。

    1.2 方法

    1.2.1 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR方法

    提取籽鵝卵泡及腦垂體的總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增促卵泡素(FSH)、催乳素(PRL)、抑制素(INH)基因。

    1.2.2 重組真核、原核表達(dá)載體構(gòu)建

    將通過(guò)PCR獲得的FSH、PRL、INH基因與pMD18T載體連接,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中,擴(kuò)增培養(yǎng)后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,并將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)。將酶切后的FSH、PRL、INH基因進(jìn)行回收,將FSH基因與與pcDNA3.0載體相連接,PRL、INH基因與pET-32a載體連接,將重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中,將重組pcDNA3.0-FSH轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中,擴(kuò)增培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒,雙酶切鑒定后進(jìn)行再次測(cè)序,將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒放置于-80 ℃冰箱中留用。

    1.2.3 PRL、INH蛋白表達(dá)及純化

    對(duì)包含重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體的BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),加入IPTG誘導(dǎo)重組載體表達(dá),用超聲波裂解儀破碎細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳,檢測(cè)PRL、INH蛋白表達(dá)情況,然后將包含重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體的BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng),超聲波裂解儀破碎細(xì)菌后收集蛋白,使用Ni層析柱進(jìn)行蛋白純化,獲得純化蛋白后放置于-80 ℃冰箱中留用。

    將包含重組pcDNA3.0-FSH載體的DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng),使用質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒,放置于-80 ℃冰箱中留用。

    1.2.4 免疫籽鵝

    選取成年產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝及產(chǎn)蛋初期的籽鵝進(jìn)行免疫,將成功構(gòu)建的重組真核表達(dá)載體pcDNA3.0-FSH、純化的PRL、INH蛋白單獨(dú)及聯(lián)合免疫籽鵝,蛋白免疫劑量每次為100 μg,重組質(zhì)粒免疫劑量每次為10 μg,每組免疫30只籽鵝。

    隔2周免疫1次,共免疫3次。

    1.2.5 產(chǎn)蛋量觀察

    觀察并統(tǒng)計(jì)免疫籽鵝及正常籽鵝的年產(chǎn)蛋數(shù)量、產(chǎn)蛋周期。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS17.0及Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差( ± )表示,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用LSD–t檢驗(yàn),當(dāng)p<0.05時(shí),表示差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 產(chǎn)蛋量情況

    統(tǒng)計(jì)4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)產(chǎn)蛋量情況,結(jié)果顯示,4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)的產(chǎn)蛋量均較正常籽鵝有所增加,其中聯(lián)合免疫的產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝、產(chǎn)蛋初期籽鵝及免疫INH的產(chǎn)蛋初期籽鵝的年產(chǎn)蛋量與正常籽鵝相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 籽鵝產(chǎn)蛋量比較情況( )

    表1 籽鵝產(chǎn)蛋量比較情況( )

    PRL 81.05±2.48 82.04±2.69 INH 81.72±2.65 82.63±3.07*聯(lián)合免疫 82.91±3.18* 83.87±3.44*項(xiàng)目 產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝 產(chǎn)蛋初期籽鵝 正常籽鵝FSH 80.47±2.23 81.61±2.64 79.62±2.69

    2.2 產(chǎn)蛋周期情況

    統(tǒng)計(jì)4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)產(chǎn)蛋周期情況,結(jié)果顯示,4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)的產(chǎn)蛋周期均較正常籽鵝有所增加,其中聯(lián)合免疫的產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝、產(chǎn)蛋初期籽鵝及免疫INH的產(chǎn)蛋初期籽鵝的產(chǎn)蛋周期與正常籽鵝相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 各組籽鵝產(chǎn)蛋周期情況(x ±s )

    3 討論

    促卵泡素(FSH)是動(dòng)物腦垂體前葉促性腺激素細(xì)胞(嗜堿性細(xì)胞)分泌的一種糖蛋白激素,對(duì)于雄性動(dòng)物的精子發(fā)生,雌性動(dòng)物卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟、排卵,乃至類(lèi)固醇激素的合成都是極為重要的調(diào)節(jié)激素[4]。在生產(chǎn)實(shí)踐中主要用于動(dòng)物的誘導(dǎo)發(fā)情和超數(shù)排卵,以及治療垂體和性腺機(jī)能障礙。催乳素(Prolactin,PRL)是垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種蛋白激素。對(duì)于哺乳動(dòng)物,PRL能直接作用于卵巢顆粒細(xì)胞,抑制促卵泡激素(FSH)誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞芳香化酶活性,使雌二醇(E2)合成減少,并抑制排卵;禽類(lèi)就巢期間,血液PRL含量明顯升高,黃體生成素(LH)和卵巢類(lèi)固醇水平下降,卵巢萎縮,排卵停止。因此,PRL在卵泡發(fā)育中具有重要作用[5]。抑制素(inhibin, INH)是一種主要由雄性睪丸支持細(xì)胞(Sertoli2 like cells)和雌性卵巢顆粒細(xì)胞(granulosa cells)分泌的二聚體糖蛋白激素,目前家禽中只有雞抑制素和活化素各亞基序列已被測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)家禽INH和ACT與哺乳動(dòng)物的同源性較高,在進(jìn)化上比較保守,尤其是雞βA亞基C-端在進(jìn)化上非常保守[6]。

    本研究通過(guò)分子生物學(xué)手段,獲得影響籽鵝產(chǎn)蛋性能的促卵泡素、催乳素和抑制素基因,并通過(guò)降低籽鵝體內(nèi)催乳素和抑制素水平,延長(zhǎng)籽鵝的產(chǎn)蛋時(shí)間和促進(jìn)籽鵝FSH的分泌,提高籽鵝體內(nèi)FSH水平,以提高籽鵝的產(chǎn)蛋性能。

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