RNA干擾抑制ABCG2表達(dá)對子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌hCG的影響

賈艷菊，崔洪艷，劉 穎，王煥榮

ATP結(jié)合匣式轉(zhuǎn)運(yùn)子G2（ATP-binding cassette family G2 transporters，ABCG2）是胎盤中表達(dá)最高的主動轉(zhuǎn)運(yùn)子[1]，由655個(gè)氨基酸組成，基因編碼區(qū)位于染色體4q22，由16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子組成，具有多態(tài)性[2-3]。最近研究表明ABCG2除可通過有效地形成母胎循環(huán)間的屏障，轉(zhuǎn)運(yùn)毒素、藥物或異生物質(zhì)及改變藥代動力學(xué)及藥效學(xué)保護(hù)胎兒外，在某些妊娠并發(fā)癥，如妊娠期糖尿病、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、胎兒生長受限（FGR）和子癇前期的發(fā)生、發(fā)展及治療中也有一定的作用[4]。

全球范圍內(nèi)，子癇前期影響2%～8%的妊娠[5]，是孕產(chǎn)婦及圍生兒病死率升高的主要原因，其臨床表現(xiàn)多樣化，至今病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[6]，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤過淺，螺旋小動脈重鑄障礙是子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，大量基礎(chǔ)研究致力于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞在子癇前期發(fā)病中的作用。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)子癇前期胎盤組織ABCG2 mRNA高表達(dá)[7]，原代培養(yǎng)的子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞在不同分化時(shí)期ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)均高于正常[8]，但其表達(dá)升高是否對滋養(yǎng)細(xì)胞的功能有影響以及相關(guān)機(jī)制仍屬未知。人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）是由胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，通過絨毛間隙進(jìn)入母血循環(huán)，故孕婦血hCG水平可反映胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的分化功能。hCG是由α和β亞基結(jié)合形成的二聚體，β亞基為hCG所特有，是臨床常用的檢測血hCG水平的指標(biāo)。βhCG水平異?？勺鳛樘ケP功能不良的早期信號，早在1934年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)子癇前期患者血hCG水平明顯升高。本文基于前期研究結(jié)果，進(jìn)一步應(yīng)用RNA 干擾 （RNA interference，RNAi） 技術(shù)使細(xì)胞ABCG2表達(dá)沉默后，將β-hCG作為評價(jià)滋養(yǎng)細(xì)胞分化及功能的指標(biāo)，分析ABCG2的表達(dá)對子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌hCG的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2016年6—12月于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院（我院）行剖宮產(chǎn)分娩的正常孕婦及重度子癇前期患者各10例，重度子癇前期診斷符合《婦產(chǎn)科學(xué)（第8版）》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)，2組孕婦均為漢族，單胎妊娠，既往無高血壓、心臟病、糖尿病及腎病史。2組孕婦終止妊娠時(shí)孕周比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（36.31±1.16）周vs.（35.41±1.09）周，t=1.794，P=0.090]，剖宮產(chǎn)術(shù)中留取無菌胎盤樣本行原代細(xì)胞培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，研究經(jīng)我院倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑兔抗人ABCG2抗體來自Abcam公司，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）應(yīng)用 PrimeScriptTM試劑盒，TRIzol、熒光定量PCR試劑盒來自Thermo Fisher Scientific公司，應(yīng)用儀器為Power SYBR Green PCR Master MIX，系統(tǒng)為ABI Prism 7900。大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司，293T細(xì)胞株購自ATCC，pSRL-SIH1-H1-GFP慢病毒載體由上海吉凱基因提供，引物由南京金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，質(zhì)粒提取純化試劑盒購自Biomega公司，DNA凝膠回收試劑盒購自碧云天公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。β-hCG檢測試劑盒購自DRG Instruments公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司，胰酶購自Gibco公司，膠原酶、Ficoll購自Sigma公司，兔抗人細(xì)胞角蛋白7（CK7）抗體、兔抗人波形蛋白（Vim）抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿購自Corning公司，其他試劑（多聚甲醛、PBS、Tween、Triton X-100、氛、氯仿、異丙醇等RNA提取所需試劑）為常規(guī)國產(chǎn)試劑。

1.3 設(shè)計(jì)合成ABCG2小干擾RNA（siRNA）靶序列根據(jù)ABCG2 mRNA在GenBank中的序列，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道以及siRNA預(yù)測工具Genscript siRNA Target Finder、Ambion siRNA Target Finder的預(yù)測結(jié)果，設(shè)計(jì)合成以下3個(gè)ABCG2的靶向siRNA序列，與任何編碼序列無同源性。ABCG2 siRNA1：正義鏈GCACAGCAAATGCTGTCCT，反義鏈AGGACAGCATTTGCTGTGC。ABCG2 siRNA2：正義鏈GCAGGGACGAACAATCATC，反義鏈 GATGATTGTTCGTCCCTGC。ABCG2 siRNA3：正義鏈CATGTACTGGCGAAGAATA，反義鏈TATTCTTCGCCAGTACATG。

1.4 驗(yàn)證慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和干擾效果

1.4.1 siRNA前體短發(fā)夾RNA（shRNA）表達(dá)退火序列的設(shè)計(jì) siRNA靶點(diǎn)序列確定后，設(shè)計(jì)2條siRNA表達(dá)元件退火序列。ABCG2 siRNA1-上游：GATCCGCACAGCAAATGCTGTCCTTTCAAGAGAAGGACAGCATTTGCTGTGCTTTTTTG；ABCG2 siRNA1-下游：AATTCAAAAAAGCACAGCAAATGCTGTCCTTCTCTTGAAAGGACAGCATTTGCTGTGCG。ABCG2 siRNA2-上游：GATCCGCAGGGACGAACAATCATCTTCAAGAGAGATGATTGTTCGTCCCTGCTTTTTTG；ABCG2 siRNA2-下游：AATTCAAAAAAGCAGGGACGAACAATCATCTCTCTTGAAGATGATTGTTCGTCCCTGCG。ABCG2 siRNA3-上游：GATCCCATGTACTGGCGAAGAATATTCAAGAGATATTCTTCGCCAGTACATGTTTTTTG；ABCG2 siRNA3-下游：AATTCAAAAAACATGTACTGGCGAAGAATATCTCTTGAATATTCTTCGCCAGTACATGG。

1.4.2 合成的shRNA序列退火形成雙鏈DNA 根據(jù)之前設(shè)計(jì)合成片段信息，合成3對互補(bǔ)的shRNA序列，兩端帶有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)黏性末端，退火后得到的雙鏈產(chǎn)物無需酶切可直接連入BamHⅠ和EcoRⅠ線性化的pSRLSIH1-H1-GFP 載體。引物溶解至 100 pmol/μL，各取 3.5 μL，在1×退火緩沖液中煮沸變性3 min，放置室溫1 h退火。退火產(chǎn)物上樣至3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.3 退火片段與線性化的pSRL-SIH1-H1-GFP載體連接、轉(zhuǎn)化及鑒定 退火產(chǎn)物按照1∶100稀釋，取5 μL做連接反應(yīng)，pSRL-SIH1-H1-GFP載體酶切，酶切產(chǎn)物上樣至1%瓊脂糖凝膠，電泳至適當(dāng)位置后，紫外燈下切膠回收。最終洗脫體積40 μL。對回收后的載體定量后，進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，提取細(xì)菌培養(yǎng)物中的質(zhì)粒并酶切鑒定。每種ABCG2 siRNA質(zhì)粒分別挑取2～3個(gè)克隆做鑒定，每種質(zhì)粒分別選擇1個(gè)克隆送測序，測序結(jié)果顯示序列無誤。

1.4.4 3種pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA表達(dá)載體在293T細(xì)胞中干擾效果的檢測 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（ABCG2在293T細(xì)胞中高表達(dá)），實(shí)驗(yàn)分組：293T細(xì)胞組，pSRL-SIH1-H1-GFP-siR-Control組 ，pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA1組，pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA2組和pSRLSIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA3組。提取各組細(xì)胞的RNA，采用紫外分光光度法測定RNA在260 nm和280 nm的吸光度，計(jì)算RNA含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）分別檢測pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA表達(dá)載體對ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，選擇可有效降低ABCG2基因表達(dá)水平的質(zhì)粒進(jìn)行下一步的慢病毒包裝。

1.5 ABCG2 siRNA慢病毒的包裝復(fù)蘇培養(yǎng)293T細(xì)胞。培養(yǎng)基為DMEM，含10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。每 2～3 天傳代 1 次，傳代比例為 1∶5～1∶10。慢病毒包裝前1天，在100 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種293T細(xì)胞，用10 mL DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度應(yīng)為50%～70%。按照說明書操作進(jìn)行慢病毒包裝，取少量濃縮后的病毒液進(jìn)行滴度測定。剩余的濃縮后病毒液按需要分裝，保存于-80℃。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測ABCG2 siRNA慢病毒感染細(xì)胞后ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)變化后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為：正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+ABCG2 siRNA組、正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+對照siRNA組、子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+ABCG2 siRNA組、子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+對照siRNA組。子癇前期及正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)后72 h，細(xì)胞完全鋪展開，以細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞為主，為未分化狀態(tài)，在該時(shí)間點(diǎn)收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，分別感染ABCG2 siRNA慢病毒及對照siRNA慢病毒，感染后48～72 h裂解細(xì)胞檢測ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。原代培養(yǎng)及處理胎盤絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測各組細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，具體步驟同作者前期研究[8]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測ABCG2 siRNA慢病毒感染后滋養(yǎng)細(xì)胞β-hCG水平實(shí)驗(yàn)分組、原代培養(yǎng)及處理胎盤絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞同1.6，分別感染ABCG2 siRNA慢病毒及對照siRNA慢病毒，隔日更換并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明分組ELISA檢測第2、4、6、8、10天上清液中的β-hCG水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的光密度值，計(jì)算對應(yīng)的樣品濃度。分別檢測3次取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABCG2 siRNA合成及慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和干擾效果驗(yàn)證

2.1.1 細(xì)胞 RNA 提取 A260/A280為 1.9～2.1，取 1 μg樣品，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V，10～15 min。

2.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNA表達(dá)載體后對ABCG2表達(dá)水平的影響 分別以293T細(xì)胞組ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平為1，各組ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平見表1。干擾后各組均可降低ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)，其中pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA2表達(dá)載體ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的下降程度最為顯著，分別降低至0.16及0.13，故選擇該質(zhì)粒進(jìn)行下一步的慢病毒包裝。

表1 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ABCG2 siRNA表達(dá)載體后ABCG2的相對表達(dá)水平 （±s）

表1 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ABCG2 siRNA表達(dá)載體后ABCG2的相對表達(dá)水平 （±s）

注：a與組 1比較，P＜0.05；b與組 2比較 P＜0.05；c與組 3比較，P＜0.05；d與組 4比較，P＜0.05；e與組 5比較，P＜0.05。

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2.2 ABCG2 siRNA慢病毒感染子癇前期和正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞后ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)變化

2.2.1 細(xì)胞RNA提取 A260/A280為1.8～2.1，取1 μg樣品，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V，10～15 min。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測各組細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平 如果分別以正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+ABCG2 siRNA組即siRNA干擾ABCG2表達(dá)后正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平為1的話，未予干擾的正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白的相對表達(dá)平均值分別為5.12及10.51，未予干擾的子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)分別為12.47及25.09，干擾后ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)分別降為2.29及3.45。見表2。

2.3 ABCG2 siRNA慢病毒感染子癇前期和正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞后不同分化時(shí)期β-hCG的變化應(yīng)用ELISA分別檢測siRNA干擾ABCG2表達(dá)前、后滋養(yǎng)細(xì)胞第 2、4、6、8、10 天上清液中的 β-hCG 水平。結(jié)果顯示，無論干擾前后，子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌βhCG水平均顯著高于正常；干擾后，正常及子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞不同分化時(shí)期分泌β-hCG水平均降低。RNA 干擾前第 2、4、6、8、10天，正常滋養(yǎng)細(xì)胞分泌hCG 水平分別為干擾后的 1.28、3.08、2.69、3.06 及1.80倍，子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞hCG水平分別為干擾后的 2.59、2.25、3.52、4.52 及 2.58 倍，干擾后子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞hCG分泌下降程度尤為顯著，明顯低于正常，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2 siRNA干擾前、后正常及子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量 （±s）

表2 siRNA干擾前、后正常及子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量 （±s）

注：a與組1比較，P＜0.05；b與組2比較，P＜0.05；c與組3比較，P＜0.05；d與組 4比較，P＜0.05。

組別 n mRNA表達(dá)量 蛋白表達(dá)量正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+ABCG2 siRNA組（組1） 3 1bcd 1bcd正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+Control siRNA組（組2） 3 5.12±0.74acd 10.51±0.65acd子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+ABCG2 siRNA組（組3） 3 2.29±0.31abd 3.45±0.34abd子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+Control siRNA組（組4） 3 12.47±1.04abc 25.09±1.95abc F 182.745 325.394 P 0.000 0.000

3 討論

ABCG2最初是從阿霉素高度耐藥的MCF7乳腺癌細(xì)胞系中克隆，分子質(zhì)量75 ku，因其是ABCG家族的第2個(gè)成員，又被稱為ABCG2。除最初發(fā)現(xiàn)的在母胎界面的屏障作用外，越來越多的研究關(guān)注其與妊娠并發(fā)癥的關(guān)系[4]。鑒于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力受損，造成“胎盤淺著床”在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的重要作用，又因妊娠的特殊性及倫理限制，無法體內(nèi)研究不同階段及疾病狀態(tài)下滋養(yǎng)細(xì)胞分化及其功能的改變，所以體外細(xì)胞系模型是主要的替代途徑之一。筆者前期研究中在原代培養(yǎng)的子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)不同分化時(shí)期ABCG2的表達(dá)均高于正常[8]。β-hCG可反映胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的分化及功能，與子癇前期有關(guān)，妊娠早期hCG升高可增加子癇前期風(fēng)險(xiǎn)[10]。本研究基于以上研究基礎(chǔ)，應(yīng)用RNAi技術(shù)使ABCG2表達(dá)沉默后，對比研究ABCG2的表達(dá)對子癇前期及正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分泌β-hCG的影響。

本研究通過siRNA預(yù)測工具結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)選取3個(gè)ABCG2基因的siRNA靶位點(diǎn)，合成3對互補(bǔ)的shRNA序列，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染ABCG2高表達(dá)的293T細(xì)胞系后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測確定干擾最有效的siRNA，與另外兩個(gè)siRNA的干擾效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可使ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低至正常（分別為0.16和0.13），進(jìn)行慢病毒包裝并感染滋養(yǎng)細(xì)胞，成功使ABCG2基因表達(dá)沉默，有效降低滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2基因的表達(dá)水平，應(yīng)用此ABCG2 siRNA慢病毒感染子癇前期和正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測原代培養(yǎng)的子癇前期及正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示無論干擾前后，子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)都高于正常，與筆者前期研究結(jié)果一致[8]。干擾前，子癇前期及正常滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA的表達(dá)分別為干擾后的5.45倍及5.12倍，蛋白的表達(dá)分別為干擾后的7.27倍及10.51倍。干擾后滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)均顯著下降，說明實(shí)驗(yàn)所用方法成功對滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行RNAi，使ABCG2表達(dá)沉默，抑制了ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)β-hCG水平在滋養(yǎng)細(xì)胞分化后開始升高，在培養(yǎng)后第6天左右達(dá)高峰后逐漸下降，無論干擾前、后子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞β-hCG水平均高于正常。目前關(guān)于子癇前期患者h(yuǎn)CG升高機(jī)制尚不明確，Panwar等[11]研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者血清β-hCG水平明顯高于正常妊娠者，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。子癇前期胎盤缺血缺氧，局部合體滋養(yǎng)細(xì)胞變性壞死，隨后出現(xiàn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞反應(yīng)性增殖、分化，在72 h內(nèi)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)楹象w滋養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)一步合成及釋放hCG[12]。hCG參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化，可促進(jìn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞融合及向合體滋養(yǎng)細(xì)胞分化，降低子宮動脈血流阻力[13]，hCG/黃體生成激素（LH）受體基因表達(dá)于子宮內(nèi)皮細(xì)胞、子宮螺旋動脈平滑肌及胎盤周圍血管，hCG與此受體結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)胎盤新生血管形成，保證妊娠期子宮及胎盤充足的血供[14]。另外hCG促進(jìn)巨噬細(xì)胞抑制因子或巨噬細(xì)胞遷移抑制因子，減少胎盤子宮界面巨噬細(xì)胞的吞噬作用，防止胎盤胎兒面組織受破壞，抑制免疫排斥，hCG還使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、白細(xì)胞介素10（IL-10）、子宮自然殺傷細(xì)胞等正常表達(dá)，促進(jìn)免疫耐受和血管生成[15]。故筆者認(rèn)為子癇前期患者胎盤合成及釋放hCG增多是疾病狀態(tài)下機(jī)體的一種代償機(jī)制，對維持滋養(yǎng)細(xì)胞分化、螺旋小動脈形成等胎盤正常血供，抑制炎癥免疫過度激活等均有重要作用，一定程度上可抑制子癇前期的發(fā)生、發(fā)展，降低疾病的嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)ABCG2表達(dá)沉默則滋養(yǎng)細(xì)胞分泌β-hCG降低，子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞尤為顯著，認(rèn)為ABCG2的正常表達(dá)是維系滋養(yǎng)細(xì)胞正常分泌βhCG的條件之一，子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2表達(dá)高于正常，為子癇前期β-hCG水平增高的原因之一，可通過導(dǎo)致β-hCG升高以達(dá)到前述抑制子癇前期發(fā)展的作用。

表3 ABCG2 siRNA慢病毒感染后滋養(yǎng)細(xì)胞分泌β-hCG水平 （IU/L，±s）

表3 ABCG2 siRNA慢病毒感染后滋養(yǎng)細(xì)胞分泌β-hCG水平 （IU/L，±s）

注：a與組 1比較，P＜0.05；b與組 2比較，P＜0.05；c與組 3比較，P＜0.05；d與組 4比較，P＜0.05。

組別 n Day2 Day4 Day6 Day8 Day10正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+ABCG2 siRNA 組（組 1） 3 5.63±0.85d 23.23±0.91bcd 52.82±1.76bcd 35.29±2.19bcd 11.78±1.98bcd正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+Control siRNA 組（組 2） 3 7.23±0.46d 71.49±0.68acd 141.89±2.6acd 108.05±5.78acd 21.25±1.79acd子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+ABCG2 siRNA 組（組 3） 3 7.30±1.27d 55.25±2.23abd 102.42±4.11abd 58.26±0.99abd 16.56±0.37abd子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞+Control siRNA 組（組 4） 3 18.92±1.03abc 124.39±2.62abc 360.16±17.13abc263.27±3.87abc 42.78±3.64abc F 125.817 1 633.853 688.602 2 333.723 109.529 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

綜上所述，筆者在前期研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞不同分化時(shí)期ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)均顯著高于正常[8]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究其原因。繼續(xù)在前期建立的體外原代培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞系中通過RNAi技術(shù)，成功將ABCG2 siRNA轉(zhuǎn)染至滋養(yǎng)細(xì)胞，使ABCG2基因表達(dá)沉默，各干擾組的β-hCG水平均低于各對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明滋養(yǎng)細(xì)胞ABCG2表達(dá)降低可導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞分泌β-hCG下降，而無論干擾前、后子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌β-hCG水平均高于正常，推測子癇前期ABCG2升高可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞分泌hCG，為保護(hù)性的代償反應(yīng)，進(jìn)而有助于抑制病情進(jìn)展。