基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1、趨化因子受體4和淋巴管新生在子宮內(nèi)膜異位癥中的意義

周雅娟，開海麗，喬海風(fēng)，張連鎖，吳劉成，劉穎蕾，劉曼華

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種常見的婦科疾病，指子宮內(nèi)膜中的腺體和基質(zhì)異位到子宮以外的部位，種植、生長形成異位病灶，常伴有盆腔痛、痛經(jīng)、不孕等臨床表現(xiàn)[1]。目前尚無學(xué)說可以明確解釋EMs的發(fā)病機(jī)制。1921年Sampson提出“經(jīng)血逆流學(xué)說”的同時(shí)提出子宮內(nèi)膜也可以通過淋巴傳播[1]。不少學(xué)者在盆腔淋巴管、淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜組織。有研究指出，在腹膜型及深部浸潤型EMs異位內(nèi)膜中淋巴管數(shù)目大于正常組織，但尚無研究明確子宮內(nèi)膜進(jìn)入淋巴系統(tǒng)的機(jī)制?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）是趨化因子的一種，與其特異性受體趨化因子受體4（CXCR4）結(jié)合后在多種惡性腫瘤淋巴管新生、淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2-3]。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的最具特異性的新生淋巴管特異性標(biāo)記物[4]，所標(biāo)記出的淋巴管數(shù)目以微淋巴管密度（microlymphatic vessel density，MLVD）表示。EMs與惡性腫瘤有相似的生物學(xué)行為，因此本研究通過檢測(cè)正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中SDF-1、CXCR4以及D2-40標(biāo)記的MLVD，探討SDF-1、CXCR4在EMs淋巴管新生、子宮內(nèi)膜細(xì)胞淋巴遷移中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年11月—2018年5月就診于南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院的患者。試驗(yàn)組為因卵巢型EMs行腹腔鏡下卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫剝除術(shù)的患者（n=20），術(shù)前行診刮術(shù)取在位內(nèi)膜，術(shù)中取囊腫壁為異位內(nèi)膜。取同期因子宮肌瘤行子宮切除或子宮肌瘤挖除術(shù)患者的子宮內(nèi)膜作為對(duì)照組（n=20）。所有患者年齡25～45歲，無其他內(nèi)外科合并癥，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未使用激素類藥物，所取標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診。取材過程嚴(yán)格遵守倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，均取得患者本人的知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑Trizol購自生工生物工程（上海）股份有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由其合成；逆轉(zhuǎn)錄、SYBR Green Master Mix購自美國 Thermo公司；SDF-1多克隆抗體、CXCR4單克隆抗體和D2-40單克隆抗體購自美國Abcam公司；免疫組織化學(xué)（免疫組化）試劑盒、鼠抗人細(xì)胞角蛋白和波形蛋白購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、10%胎牛血清和Ⅳ型膠原酶購自美國Gibco公司；人SDF-1α購自美國PeproTech公司。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)SDF-1和CXCR4 mRNA表達(dá)水平 用Trizol抽提組織mRNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。采用梯度PCR擴(kuò)增儀逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為參照物，反應(yīng)條件均按照試劑盒說明書執(zhí)行。所需引物見表1。

表1 RT-PCR所需引物序列

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)SDF-1、CXCR4和D2-40蛋白表達(dá)水平 將所有標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片并脫蠟，二甲苯、乙醇脫水，進(jìn)行HE染色確認(rèn)為子宮內(nèi)膜組織。切片經(jīng)枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)后，操作步驟嚴(yán)格按照SP免疫組化試劑盒進(jìn)行。磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。鏡下觀察，以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)呈清晰棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。采用Image-J圖像分析系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行分析，計(jì)算SDF-1、CXCR4陽性細(xì)胞的積分光密度（integrated optical density，IOD）和總面積（area）。以平均光密度值（mean denisty，MD）作為 SDF-1、CXCR4 的表達(dá)強(qiáng)度，MD=IOD/area。D2-40陽性定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，呈黃褐色。每個(gè)D2-40染色陽性的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇或單個(gè)微小脈管均計(jì)數(shù)為1個(gè)微淋巴管。MLVD判定方法[5]：先在低倍鏡下（×100）選取脈管數(shù)目最多的兩個(gè)區(qū)域，即“熱點(diǎn)”，然后在高倍鏡下（×200）觀察每個(gè)熱點(diǎn)中的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)其中脈管數(shù)。最后計(jì)算2個(gè)熱點(diǎn)、5個(gè)視野的平均值作為該標(biāo)本的MLVD。

1.3.3 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[6]并加以改進(jìn)。將所取內(nèi)膜標(biāo)本用PBS沖洗3次后剪碎，以0.125%膠原酶37℃消化30 min后于倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞脫落、游離后，將消化液吸出，經(jīng)400目不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過濾至含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基的離心管內(nèi)終止消化。將未消化組織重復(fù)上述步驟2～3次。收集的細(xì)胞濾液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液混懸后轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。波形蛋白主要表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞角蛋白表達(dá)于腺上皮細(xì)胞，選擇相應(yīng)的抗體采用免疫組化法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。實(shí)驗(yàn)所用基質(zhì)細(xì)胞均為2～6代。

1.3.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按4×105/mL的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿后用100 μL吸頭在6孔板內(nèi)垂直劃痕，用PBS清洗3次。對(duì)照組孔內(nèi)加入DMEM-F12培養(yǎng)液，試驗(yàn)組孔內(nèi)加入等體積50 ng/mL SDF-1溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在倒置光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取點(diǎn)觀察并拍照。采用Image-J圖像分析劃痕面積。細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕寬度×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白質(zhì)及MLVD比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；異位內(nèi)膜組或在位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜組的比較及細(xì)胞遷移率的組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位、在位及正常內(nèi)膜中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白在異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜，在位內(nèi)膜中的表達(dá)水平高于正常內(nèi)膜，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01），見表1。SDF-1、CXCR4在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腺體細(xì)胞中均有表達(dá)。3組內(nèi)膜中，SDF-1在腺體細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度均高于基質(zhì)細(xì)胞。CXCR4在異位內(nèi)膜中主要表達(dá)于腺體細(xì)胞，而在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)強(qiáng)度高于腺體細(xì)胞。見圖1（見封三）。

表1 異位、在位及正常內(nèi)膜中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況 （±s）

表1 異位、在位及正常內(nèi)膜中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況 （±s）

組別 n SDF-1 CXCR4 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白正常內(nèi)膜組① 20 1.014±0.165 0.389±0..037 1.194±0.238 0.376±0.027在位內(nèi)膜組② 20 2.148±0.179 0.445±0.031 1.739±0.295 0.409±0.042異位內(nèi)膜組③ 20 4.318±0.236 0.509±0.043 2.889±0.347 0.477±0.031 t①vs.② 20.788 5.157 6.430 2.942 P 0.000 0.000 0.000 0.006 t①vs.③ 51.249 9.424 18.008 10.961 P 0.000 0.000 0.000 0.000 t②vs.③ 34.696 5.906 11.665 5.962 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 異位、在位及正常內(nèi)膜中D2-40標(biāo)記的MLVD比較D2-40陽性定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。正常內(nèi)膜中淋巴管管腔較大、形態(tài)完整，在位和異位內(nèi)膜中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞多不連續(xù)、管腔不完整、管壁?。ㄒ妶D1，見封三）。異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜中MLVD分別為（20.98±1.77）LV/mm2、（5.67 ±1.45）LV/mm2、（1.77 ±1.22）LV/mm2。異位內(nèi)膜中MLVD高于在位和正常內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=20，t=34.912，P=0.000；t=39.970，P=0.000）。在位內(nèi)膜中MLVD高于正常內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=20，t=9.179，P=0.000）。

2.3 異位內(nèi)膜細(xì)胞鑒定結(jié)果異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核較大，細(xì)胞膜表面有胞漿突起，邊界不清，呈紡錘狀。免疫組化結(jié)果示：細(xì)胞角蛋白陰性，波形蛋白陽性，其純度達(dá)95%以上。見圖2（見封三）。

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)24 h后，DMEM-F12組劃痕面積大于SDF-1組（見圖3）。DMEM-F12組細(xì)胞遷移率為（36.06±2.92）%，SDF-1組細(xì)胞遷移率為（50.17±2.76）%，SDF-1組細(xì)胞遷移率高于 DMEMF12 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=20，t=15.714，P=0.000）。見圖3（見封三）。

3 討論

EMs是一種常見的育齡期女性疾病，其發(fā)生機(jī)制尚不明確。SDF-1是CXC類趨化因子，由骨髓、子宮內(nèi)膜等多種器官的基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，與其特異性受體CXCR4結(jié)合后激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)靶細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架重排，廣泛參與多種生理、病理過程[7]。研究報(bào)道，卵巢癌、乳腺癌患者體內(nèi)過度表達(dá)雌激素受體（ER），雌二醇（E2）可以刺激癌細(xì)胞中SDF-1分泌增加，并通過E2-SDF-1-CXCR4通路介導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖，SDF-1作為雌激素的直接作用靶點(diǎn)，在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8]。EMs是雌激素依賴性疾病，因此本研究對(duì)SDF-1、CXCR4與EMs發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系進(jìn)行了探究。

近年來，SDF-1、CXCR4與淋巴管生成、腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究指出，胰腺癌[2]、乳腺癌[3]患者的原發(fā)性腫瘤、癌旁組織、淋巴結(jié)中SDF-1表達(dá)水平逐漸升高，并且CXCR4表達(dá)水平越高，腫瘤原發(fā)部位的浸潤率越高；同時(shí)，存在淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期越高的患者新生淋巴管數(shù)目越多，提示SDF-1、CXCR4參與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。EMs雖是良性疾病，但具有轉(zhuǎn)移性、侵襲性和高復(fù)發(fā)率等惡性生物學(xué)特征。在本研究中，采用RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)正常、在位和異位內(nèi)膜中SDF-1和CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組內(nèi)膜中SDF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平顯著高于在位和正常內(nèi)膜，在位內(nèi)膜中的表達(dá)水平顯著高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）。有研究指出，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在雌激素刺激下可分泌SDF-1，并呈時(shí)間和濃度依賴性[9]。眾所周知，EMs是一種雌激素依賴性疾病，異位組織中雌激素代謝紊亂，其濃度是在位內(nèi)膜的4～5倍[10-11]，因此在高雌激素作用下，SDF-1表達(dá)水平響應(yīng)性地升高，該趨勢(shì)與本研究結(jié)果一致。鑒于以上研究結(jié)果，推測(cè)SDF-1、CXCR4表達(dá)異常參與了子宮內(nèi)膜異位病灶的形成，在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的淋巴遷移中發(fā)揮一定作用。

D2-40是一種腎小球足突細(xì)胞膜表面的跨膜黏蛋白，既不能使有周細(xì)胞/平滑肌的大淋巴管顯色，也不與血管內(nèi)皮反應(yīng)，對(duì)新生淋巴管具有高度特異性[12]。D2-40標(biāo)記陽性的淋巴管數(shù)目通常以MLVD表示。在腹膜型、深部浸潤型EMs中，異位病灶MLVD較相對(duì)應(yīng)的正常組織均升高。本研究對(duì)卵巢型EMs異位組織進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜中的MLVD顯著增高，高于在位和正常內(nèi)膜（P＜0.05），在位內(nèi)膜中MLVD約為正常內(nèi)膜的3倍，進(jìn)一步證實(shí)了淋巴系統(tǒng)在子宮內(nèi)膜異位過程中扮演重要角色。Zhuo等[13]在小鼠體內(nèi)注射SDF-1，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)新生淋巴管數(shù)目與SDF-1呈濃度相關(guān)性，說明SDF-1可直接促進(jìn)淋巴管生成。同時(shí)SDF-1可利用相關(guān)通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子 C（VEGF-C）分泌[14]，VEGF-C 與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的膜型酪氨酸激酶受體VEGFR-3結(jié)合后，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)淋巴管生成[15]。因此，EMs中SDF-1、CXCR4表達(dá)升高可能促進(jìn)淋巴管新生，為內(nèi)膜細(xì)胞淋巴傳播提供了條件。

趨化因子作為趨化介質(zhì)，其基本功能是吸引表達(dá)相應(yīng)受體的靶細(xì)胞沿濃度梯度趨化性遷移。在本研究中，經(jīng)SDF-1培養(yǎng)后的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移率高于對(duì)照組（P＜0.05），表明SDF-1可以有效促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移。本研究觀察到在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中新生淋巴管管壁薄，管腔不完整，呈擴(kuò)張狀態(tài)，異位內(nèi)膜中的淋巴管多位于囊腔面。這些形態(tài)特征有利于CXCR4陽性的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞侵襲，內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)入新生淋巴管后沿SDF-1濃度梯度趨化性遷移，在SDF-1高表達(dá)的部位種植、生長，形成異位囊腫，完成淋巴途徑遷移。

綜上所述，EMs中SDF-1、CXCR4高表達(dá)，新生淋巴管數(shù)目增多，提示SDF-1、CXCR4可能與EMs淋巴管新生、內(nèi)膜細(xì)胞淋巴遷移有一定關(guān)聯(lián)。EMs發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，能否將降低SDF-1、CXCR4的表達(dá)、阻斷淋巴管生成作為治療該疾病新的切入點(diǎn)，仍需進(jìn)一步的探究。