宮頸癌新輔助化療前后BAG-1、MCM2的表達及其與化療療效的相關性

宋麗娟，向 琳，金 榮，康雅瓊，李曉琴，魏春燕，戴銀橋，張騫文，狄曉鴻

宮頸癌是發(fā)展中國家女性癌癥中發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤[1]，也是嚴重威脅女性生命和生活質量且死亡率很高的惡性腫瘤，近年來，其發(fā)病年齡也趨于年輕化。宮頸癌5年生存率約55%，近50%患者治療后復發(fā)轉移。甘肅省是宮頸癌高發(fā)省份，宮頸癌病死率在全國也處于前列[2]，大多患者就診時即為局部晚期（巨塊型）宮頸癌。新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NACT）是宮頸癌治療的重要手段之一，然而隨著NACT在臨床的廣泛應用，發(fā)現(xiàn)部分宮頸癌患者對NACT不敏感，從而影響化療效果并貽誤治療時機。因此，尋找與NACT藥物敏感性相關因子，是宮頸癌個體化治療的關鍵所在。細胞凋亡在腫瘤細胞對化療藥物的敏感性方面發(fā)揮著重要作用，細胞凋亡信號途徑激活能增強多種腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，而凋亡信號傳導通路缺陷或抑制可導致腫瘤細胞對化療藥物抵抗性增加[3]。B細胞淋巴瘤基因2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）結合致癌基因1（Bcl-2 associated athanogene-1,BAG-1）是一個凋亡相關的多功能蛋白，具有抗細胞凋亡的作用[4]。BAG-1可與Bcl-2結合，通過影響蛋白質的穩(wěn)定性而顯著增強Bcl-2的抗凋亡作用[5]。微小染色體維持蛋白 2（mini chromosome maintenance protein 2,MCM2）是一種細胞周期蛋白，是DNA復制起始的主要調控因子之一，MCM2過表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。目前，BAG-1及MCM2蛋白表達與宮頸癌NACT療效的相關性報道尚少見。本研究通過免疫組織化學（免疫組化）檢測NACT前、后宮頸癌組織中BAG-1及MCM2蛋白的表達，并分析其與化療療效的相關性，以期為尋找可以預測宮頸癌化療療效的生物標志物提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象2015年1月—2018年6月甘肅省腫瘤醫(yī)院（我院）收治的宮頸癌患者共312例，選擇符合以下標準者入組研究：①病理確診為宮頸癌，包括鱗狀細胞癌和腺癌；②國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）分期Ⅰb2~Ⅱa2期；③首次治療前未接受過任何抗腫瘤治療，且首次治療在我院進行并完成全程治療；④肝腎功能正常；⑤未合并其他惡性腫瘤；⑥行廣泛子宮切除+雙側盆腔淋巴結清掃術。排除標準：①術前接受過放療、非鉑類化療藥物化療、生物免疫治療等抗腫瘤治療；②出現(xiàn)嚴重化療不良反應而終止治療；③合并其他惡性腫瘤；④嚴重的心、肝、腎等臟器功能不全；⑤患有嚴重的神經、精神疾??；⑥病歷資料不完整。最終納入宮頸癌患者90例（宮頸癌組），收集同一患者化療前宮頸活檢及化療后手術切除標本石蠟包埋組織。選擇60例同期因子宮肌瘤手術切除的正常宮頸組織作為正常對照組。

1.2 主要試劑兔抗人單克隆抗體BAG-1（濃縮型，Y166）購自英國Abcam公司，兔抗人單克隆抗體MCM2（即用型，ZA-0642）及EnVision兩步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化檢測方法所有石蠟包埋樣本均采用免疫組化EnVision兩步法檢測組織中BAG-1及MCM2蛋白的表達。BAG-1工作濃度為1∶1 000，MCM2為即用型抗體。所有石蠟包埋組織均切成4 μm厚切片，經常規(guī)脫蠟脫水后，檸檬酸鹽（pH=6.0）高溫高壓修復5 min，冷卻至室溫后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次×3 min，滴加3%H2O2去離子水常溫10 min以降低內源性過氧化物酶活性。之后PBS沖洗3次×3 min，滴加一抗（BAG-1工作濃度1∶1 000）37℃溫箱孵育2 h，從溫箱取出濕盒，PBS沖洗3次×3 min，滴加二抗37℃溫箱孵育20 min，PBS沖洗 3次×3 min，DAB 顯色 5 min，蘇木精復染后封片。PBS代替一抗為陰性對照。

1.4 免疫組化檢測結果判定標準BAG-1定位于細胞質/核，根據(jù)Xie等[6]的評價標準，采用著色百分比及著色強度相結合的判讀模式。著色比例：0分，細胞無著色；1分，＜30%細胞著色；2分，31%～70%細胞著色；3分，＞71%細胞著色。著色強度：0分，細胞無著色；1分，微弱淡黃色；2分，中等強度棕黃色；3分，強棕褐色。將兩項得分相加，0～3分為低表達，4～6分為高表達。MCM2定位于細胞核，根據(jù)Amaro等[7]的評價標準，采用著色比例評價標準。無細胞著色為0分，陽性細胞數(shù)＜25%為1分，26%～75%為2分，＞75%為3分。0分和1分為低表達，2分和3分為高表達。

1.5 治療方法NACT方案為以鉑類為基礎化療方案：紫杉醇聯(lián)合順鉑[8]。紫杉醇150 mg/m2+順鉑75 mg/m2靜脈化療，每21 d為1個療程，均化療2個療程?；熐昂筮M行常規(guī)婦科檢查、B型超聲（B超）、胸片、血常規(guī)及心電圖檢查?；熃Y束2周，根據(jù)婦科檢查及B超情況，綜合評價療效后，均行廣泛子宮切除+雙側盆腔淋巴結清掃術。本研究經甘肅省醫(yī)學科學研究院倫理委員會批準，所有患者化療前均簽署知情同意書。

1.6 臨床療效判定標準根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）療效判定標準[9]判斷臨床療效。完全緩解（CR）：所有腫瘤病灶完全消失；部分緩解（PR）：腫瘤病灶縮小≥50%以上；穩(wěn)定或無變化（SD）：腫瘤病灶變化介于PR和進展（PD）之間；PD：腫瘤病灶增大超過25%或出現(xiàn)新腫瘤病灶。CR＋PR為臨床有效，SD＋PD為臨床無效。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定性資料采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗，若T＜5，采用校正χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料90例宮頸癌患者年齡30～69歲，中位年齡47歲。鱗狀細胞癌76例，其中高分化11例、中分化37例、低分化28例；腺癌14例，其中高分化2例、中分化8例、低分化4例。腫瘤最大徑線≥4 cm者57例，＜4 cm者33例。FIGO分期：Ⅰb2~Ⅰb3期38例，Ⅱa1~Ⅱa2期52例。所有病理切片均由2位副高級職稱以上病理醫(yī)生根據(jù)FIGO 2018分期標準進行診斷及復核，所有病例臨床病理資料均完整。

2.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織中BAG-1及MCM2表達情況BAG-1及MCM2蛋白在宮頸癌組織中的高表達率均高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），見表1。

表1 BAG-1及MCM2蛋白在宮頸癌組及正常宮頸組織中的表達[例（%）]

2.3 宮頸癌NACT前、后BAG-1及MCM2蛋白表達變化NACT前宮頸活檢組織及NACT后手術切除標本中BAG-1及MCM2蛋白高表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 BAG-1及MCM2蛋白NACT前、后表達情況[例（%）]

2.4 NACT臨床療效及與宮頸癌臨床病理特征的關系所有入組患者NACT結束2周后根據(jù)WHO療效判定標準進行療效評價。90例宮頸癌患者中有效 59例（65.6%），其中 CR 6例（6.7%）、PR 53例（58.9%）；無效31例（34.4%），其中SD 27例（30%）、PD 4例（4.4%）。NACT療效與年齡、病理類型、分化程度、腫瘤最大徑線及FIGO分期均無關（均P＞0.05），見表3。

表3 NACT化療療效與臨床病理特征的關系[N=90，例（%）]

2.5 BAG-1及MCM2蛋白表達與NACT療效的關系化療有效組BAG-1高表達率低于無效組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），見表4及圖1（見后插二）。MCM2高表達率在2組間相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4及圖 2（見后插二）。

表2 BAG-1及MCM2蛋白NACT前、后表達情況[例（%）]

3 討論

NACT可縮小腫瘤體積、改善宮旁浸潤情況、降低手術難度、提高手術成功率、降低盆腔淋巴結轉移率[10]。以鉑類為基礎的聯(lián)合化療在宮頸癌NACT中占重要地位[11]，但化療中出現(xiàn)的腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象卻又嚴重影響臨床療效和患者預后。因此，深入研究以鉑類為基礎的化療MDR形成機制，尋找藥物敏感性靶基因位點作為研究耐藥形成的切入點，是腫瘤研究與治療中的難點，也是國內外研究熱點，是亟待解決的關鍵問題，具有重要的理論意義和實際價值。

鉑類藥物抗腫瘤主要是通過與腫瘤細胞DNA結合，形成鉑-DNA螯合物，造成DNA雙螺旋扭曲、解旋及染色體破壞，抑制腫瘤細胞DNA復制，并損傷其細胞膜上的結構，使細胞停滯于G2期，從而誘導細胞凋亡。鉑類藥物耐藥與多種因素相關，目前認為主要與谷胱甘肽轉移酶（GST）活性增強[12]、DNA損傷修復增強、拓樸異構酶活性改變、細胞凋亡抑制等有關。細胞凋亡和腫瘤MDR是目前影響化療療效最關鍵的兩個因素。多數(shù)化療藥物通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮作用，如果抗細胞凋亡通路異常激活或細胞凋亡通路失活，導致抗凋亡基因過表達或促凋亡基因丟失，都會導致腫瘤細胞耐藥。

抗凋亡蛋白表達增加是細胞凋亡抑制最主要的原因之一，可以降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，導致MDR發(fā)生。BAG-1是一種抗凋亡蛋白，可與Bcl-2、多種核激素受體和Hsp70相互作用[13]。BAG-1具有多種亞型，通過與大量的細胞靶點相互作用來實現(xiàn)其抗凋亡作用。國內外研究表明，BAG-1在正常組織幾乎不表達，而在許多惡性腫瘤中高表達，且證實BAG-1調控的信號通路在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移以及患者對癌癥治療的反應性及預后等方面起重要作用。BAG-1在非小細胞肺癌中高表達，與腫瘤侵襲及腫瘤細胞對酪氨酸激酶抑制劑產生抵抗相關[14]。Huang等[15]在體內外研究中發(fā)現(xiàn)，通過小干擾RNA（siRNA）下調BAG-1在結直腸癌細胞中的表達，可以顯著提高腫瘤細胞凋亡速率，并縮小腫瘤體積，推斷BAG-1可能是結腸直腸癌治療的基因靶標。Kilbas等[16]通過siRNA轉染技術使BAG-1表達降低，可導致MCF-7乳腺癌細胞對由順鉑或紫杉醇誘導的細胞凋亡敏感性增強；BAG-1基因沉默后，化療藥物誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡增加，細胞增殖能力降低，推測針對BAG-1靶向治療可能會提高化療藥物治療乳腺癌的療效。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，進展期頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細胞顯示出對順鉑的抵抗性，且伴有BAG-1蛋白表達增加。經siRNA干擾后，BAG-1表達水平降低可導致HNSCC對順鉑敏感性的顯著改善，推斷BAG-1表達增加與順鉑耐藥和腫瘤侵襲相關，BAG-1過表達可能是原發(fā)性或復發(fā)性HNSCC患者順鉑耐藥的生物標志物，靶向BAG-1治療可能有助于改善順鉑耐藥。此外，BAG-1在宮頸癌HEN-16-2/CDDP MDR細胞中也過表達，其過表達可通過降低MDR細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）活性而引起對細胞凋亡的抵抗性[18]。本研究結果顯示，NACT有效組中BAG-1表達水平低于無效組，提示BAG-1低表達患者對以鉑類為基礎NACT更敏感，療效更好，這與文獻報道相一致，提示BAG-1可以作為預測宮頸癌NACT療效的生物標志物。

MCM2屬于MCM蛋白質家族，現(xiàn)已有10個家族成員被發(fā)現(xiàn)，家族成員高度同源且保守，是DNA復制的關鍵調控因子之一。真核生物中MCM通常由MCM2～MCM7蛋白形成一種異六聚體復合物[19]，是細胞復制起始的關鍵復合物，在G1期主要以無活性雙六聚體形式在復制起始點組裝異六聚體復制解旋酶復合物，為細胞進入S期做準備?；蚪M結構改變導致細胞異常增殖是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中最主要的原因。研究發(fā)現(xiàn)，MCM家族中的MCM2在正常組織和靜止期細胞幾乎不表達，而在增殖、轉化的惡性腫瘤中過表達，其表達水平和活性在保持基因組的穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用，MCM2異常表達與腫瘤發(fā)生密切相關[20]。左元元等[21]對宮頸液基細胞蠟塊及活檢組織研究發(fā)現(xiàn)，MCM2表達隨宮頸上皮內病變嚴重程度的增加而升高，且與人乳頭瘤病毒（HPV）感染密切相關，推薦MCM2用于宮頸癌前病變人群的分流管理。Zheng[22]的研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌和癌前病變中，MCM2過表達并且與高危型HPV呈正相關，聯(lián)合檢測HPV及MCM2可以提高診斷的敏感度和特異度。Das等[23]運用聚合酶鏈反應（PCR）、免疫組化及蛋白質印跡等方法對宮頸癌細胞株及宮頸癌組織進行研究發(fā)現(xiàn)，MCM2在宮頸癌高表達，但其表達水平與宮頸癌臨床病理分期無關。本研究中，MCM2在NACT前、后均呈高表達，且MCM2高表達率在化療有效組和化療無效組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明MCM2與NACT療效無關，并不能有效預測宮頸癌NACT療效。關于MCM2表達與宮頸癌化療療效之間的關系，國外尚未有相關報道，國內僅有的幾篇文獻中，結果也不一致。因此，關于MCM2與宮頸癌NACT療效之間的關系還有待于大樣本研究證實。

綜上所述，本研究結果提示宮頸癌NACT前、后BAG-1及MCM2蛋白表達均無明顯變化，但NACT有效組BAG-1表達明顯低于無效組，而MCM2在有效組和無效組均呈高表達。故在宮頸癌NACT前，檢測BAG-1表達情況有望成為預測以鉑類為基礎的NACT療效的參考指標，也可能為宮頸癌的治療提供新的基因靶點，為宮頸癌新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)和理論基礎。