沉默MMP-2對人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

徐 勛，盧 艷，趙冰冰，姚德生，伍光騰，董婷婷，馮一鳴，馬秀珍，龍 穎

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展與人乳頭瘤病毒（HPV）感染密切相關(guān)[1]。在宮頸癌的病理類型中，鱗狀細(xì)胞癌約占85%，腺癌約占10%~15%，鱗腺癌約占3%[2]。宮頸癌的治療主要為手術(shù)、放療和化療，晚期患者療效不理想，然而多數(shù)患者確診時已為中晚期[3-4]。明確宮頸癌發(fā)生、發(fā)展機制是治療宮頸癌的關(guān)鍵?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）是由Liotta等[5]在高度轉(zhuǎn)移的鼠腫瘤移植培養(yǎng)液中首次發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵酶。其通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)新生血管的形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附等作用，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有研究顯示在人體腫瘤細(xì)胞中大概率檢測到了MMP-2表達(dá)的升高，并且與腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后有關(guān)。已經(jīng)有大量的研究結(jié)果證實隨著宮頸癌病變的進(jìn)展，MMP-2的表達(dá)呈上升趨勢，其表達(dá)與臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[6-8]。但MMP-2對宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的影響以及在細(xì)胞中的表達(dá)未曾報道。本研究穩(wěn)轉(zhuǎn)MMP-2沉默慢病毒到宮頸癌SiHa細(xì)胞中，通過細(xì)胞功能學(xué)實驗觀測MMP-2對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響，并建立裸鼠模型，觀測其對裸鼠成瘤能力的影響，探討MMP-2對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，從而為宮頸癌的診斷和治療提供可能的靶點。

1 材料與方法

1.1 研究材料宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞、MMP-2沉默慢病毒轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒購自大連TaKaRa公司，MMP-2抗體購自美國Abcam公司，IX51型熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，BALB/C裸鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞接種于6孔板中，在37℃、50 mL/L CO2條件下，用DMEM（含 10%胎牛血清）進(jìn)行培養(yǎng)，隨機選取其中處在對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染MMP-2基因沉默病毒（MMP-2-LV組）和其陰性對照病毒（NC-LV組）。轉(zhuǎn)染72、96 h后顯微鏡下觀察結(jié)果，轉(zhuǎn)染96 h后熒光最強，轉(zhuǎn)染后經(jīng)嘌呤霉素篩選的6～7 d收獲細(xì)胞。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)首先取MMP-2-LV組和NC-LV組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞提取蛋白，用BCA法測定各組細(xì)胞蛋白的濃度，蛋白變性后上樣，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈（SDS-PAGE），然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，再室溫封閉2 h；抗體孵育：1×TBST洗滌3次后，相應(yīng)加入一抗稀釋液（稀釋倍數(shù)為1∶100）稀釋后的一抗離心管中，在4℃下孵育過夜取出用1×TBST洗滌3次后加入二抗（稀釋倍數(shù)為1∶1 000）避光孵育1 h。最后用凝膠成像儀觀測條帶，并用Image J軟件分析條帶灰度值計算各條帶對應(yīng)的蛋白表達(dá)量，重復(fù)實驗3次。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力選取MMP-2-LV組、NC-LV組對數(shù)期的SiHa細(xì)胞100μL（細(xì)胞密度為3000個/孔）接種入96孔板后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在24、48、72 h后向每孔加入10 μL CCK-8工作液，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)95 min后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測（以450 nm為吸收波長，620 nm為參比波長）各孔吸光度值（OD值），記錄結(jié)果，并據(jù)此用GraphPad Prism 5繪制細(xì)胞生長曲線，實驗重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡用適量胰酶（無EDTA）消化、收集轉(zhuǎn)染驗證成功后的2組宮頸癌SiHa細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌重懸細(xì)胞后加入1×的Binding Buffer 500 μL、APC Annexin Ⅴ和 7-ADD 各 5 μL 混勻制成細(xì)胞懸液，室溫反應(yīng)15 min后置于冰上，40 min內(nèi)送流式細(xì)胞儀上機檢測細(xì)胞凋亡率，上機前用尼龍網(wǎng)過濾混勻后的細(xì)胞懸液，實驗重復(fù)3次。

1.7 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力各取MMP-2-LV組和NC-LV組對數(shù)期的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞消化、離心、重懸制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞終密度為3×105個/mL。下室加入500 μL的DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），把小室置入24孔板。上室加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)18 h后。用棉簽把上室細(xì)胞清除，以4%多聚甲醛固定穿入下室的細(xì)胞15 min、以0.1%結(jié)晶紫對細(xì)胞進(jìn)行染色。倒置顯微鏡下拍照并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.8 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力各取MMP-2-LV組和NC-LV組細(xì)胞融合度為85%的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞洗滌、消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞終密度為1×106個/mL備用。將在-20℃冰箱保存的Matrigel基質(zhì)膠置于4℃冰箱中解凍后，用DMEM培養(yǎng)基稀釋（稀釋倍數(shù)1∶8）制成混合液，移液槍吸取其中85 μL加入Transwell小室上室底部，并置于恒溫培養(yǎng)箱中形成凝膠，在Transwell小室上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL DMEM培養(yǎng)基（含20%胎牛血清），把小室置入24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。用棉簽將上室的細(xì)胞清除、用4%多聚甲醛固定穿入下室的細(xì)胞16 min，并用0.1%結(jié)晶紫將其染色，最后用水洗凈、晾干。顯微鏡下拍照后計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.9 裸鼠成瘤實驗各取對數(shù)生長的MMP-2-LV組和NCLV組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞后，分別接種到2組裸鼠中（4～5周齡BALB/C裸鼠，共12只，體質(zhì)量14～17 g，本實驗符合動物倫理學(xué)規(guī)定），每組6只。從裸鼠腋下脊柱旁皮下注入，接種量為150 μL/只（1×107個細(xì)胞）。5～8 d后相繼觸摸到裸鼠皮下結(jié)節(jié)，之后每4 d用尺子測量瘤體長徑（D）和短徑（d），并按照公式體積（V）=D×d2×0.5（D、d以 mm 為單位）計算腫瘤體積。注射后的第5周處死裸鼠，快速分離皮下瘤體并拍照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察慢病毒對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果構(gòu)建好的慢病毒分別轉(zhuǎn)染宮頸鱗癌SiHa 72 h后，分別用明場和熒光觀察并拍照各組細(xì)胞同一視野的細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，隨機選擇5個視野拍照對比觀察發(fā)現(xiàn)2組綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)的細(xì)胞在各組中的比例均大于85%，因此認(rèn)為SiHa細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染，見圖1（見后插一）。

2.2 轉(zhuǎn)染后2組SiHa細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，MMP-2-LV組MMP-2 mRNA的相對表達(dá)量為0.230±0.011，NC-LV 組為 0.883±0.015，MMP-2-LV組低于NC-LV組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t=63.310，P=0.000）。

Western blotting實驗結(jié)果顯示，MMP-2蛋白相對表達(dá)量為 0.718±0.026，NC-LV 組為 1.234±0.084，MMP-2-LV組低于NC-LV組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t=10.135，P=0.001）。見圖 2。

圖2 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染MMP-2沉默慢病毒后宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)變化

2.3 沉默MMP-2對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲能力及遷移能力的影響CCK-8法結(jié)果顯示，MMP-2-LV組細(xì)胞增殖倍數(shù)為1.03±0.02，NC-LV組為1.20±0.01，MMP-2-LV組細(xì)胞增殖倍數(shù)低于NC-LV組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t=16.214，P=0.000），見圖3A（見后插一）。

MMP-2-LV組（n=5）細(xì)胞凋亡率為（12.83±4.08）%，NC-LV 組（n=4）為（6.06±0.75）%，MMP-2-LV組高于NC-LV組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.232，P=0.014），見圖 3B（見后插一）。

Tranwell侵襲實驗結(jié)果顯示，MMP-2-LV組細(xì)胞穿膜數(shù)為（34.80±1.79）個，NC-LV組為（88.40±6.11）個，MMP-2-LV組穿膜細(xì)胞數(shù)較NC-LV組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，t=-18.833，P=0.000），見圖3C（見后插一）。

Transwell遷移實驗顯示，MMP-2-LV組（n=4）穿膜細(xì)胞數(shù)為（438.50±146.52）個，NC-LV 組（n=5）穿膜細(xì)胞數(shù)為（759.00±183.00）個，MMP-2-LV 組穿膜細(xì)胞數(shù)較NC-LV組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.834，P=0.025），見圖 3D（見后插一）。

2.4 裸鼠成瘤實驗MMP-2-LV組和NC-LV組的裸鼠成瘤率為100%，第37天處死小鼠取瘤、測量顯示，MMP-2-LV組裸鼠腫瘤的體積平均為（63.99±18.76）mm3，NC-LV組裸鼠腫瘤的體積平均為（309.06±67.69）mm3，MMP-2-LV 組小于 NC-LV 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2組的第1只為預(yù)實驗小鼠，統(tǒng)計樣本量 n=5，t=7.801，P=0.000），見圖 4（見后插一）。

3 討論

宮頸癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球每年宮頸癌新發(fā)病例約52.9萬，死亡病例約27萬，其中90%在發(fā)展中國家[9]。近年，我國宮頸癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤第2位，且呈上升趨勢[10]。因此，宮頸癌的治療和診斷一直是婦科腫瘤的研究重點。

現(xiàn)有研究顯示在多種實體瘤中均檢測到了MMP-2表達(dá)升高，且與腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)[11]。Damodharan等[12]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中MMP-2表達(dá)活性增加，釋放生長因子從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖生長。Shen等[13]研究發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜組織中MMP-2的表達(dá)水平低于胃體癌組織，而無淋巴轉(zhuǎn)移者的胃癌組織中MMP-2表達(dá)量低于伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，在TNM分期中MMP-2表達(dá)隨分期的升高而增高。Toren等[14]研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在膀胱癌組織中呈高表達(dá)，而在正常膀胱組織或膀胱良性腫瘤中不表達(dá)或者低表達(dá)，且MMP-2的表達(dá)與膀胱癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。在MMP-2與宮頸癌關(guān)系的研究方面，已經(jīng)有大量的研究結(jié)果證實隨著宮頸病變的進(jìn)展，MMP-2的表達(dá)呈上升趨勢，故大膽推測MMP-2充當(dāng)宮頸癌的“致癌因子”。

為了研究MMP-2對人宮頸癌生物學(xué)特性的影響，本研究轉(zhuǎn)染MMP-2沉默病毒于人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，由PCR和Western blotting驗證轉(zhuǎn)染成功后，對比觀察其與陰性對照組之間CCK-8、Transwell的侵襲、遷移、凋亡和裸鼠成瘤的實驗結(jié)果，結(jié)果顯示，MMP-2沉默組相較于陰性對照組的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯降低，而細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞增殖率有所降低。因此，推測MMP-2促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展主要是通過促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移來實現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞的侵襲性行為也對腫瘤的進(jìn)展發(fā)揮了重要作用，而在不斷地研究腫瘤細(xì)胞侵襲性行為時發(fā)現(xiàn)，血管生成與實體瘤的轉(zhuǎn)移及快速增長密切相關(guān)，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在這個過程中發(fā)揮著重要作用[15]。有研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在刺激多種腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移方面與VEGF關(guān)系密切[16-17]。Lamoreaux等[18]和Zucker等[19]的研究表明，VEGF與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是通過VEGF刺激MMP-2的表達(dá)和抑制金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）的表達(dá)實現(xiàn)的[20]。

總之，在細(xì)胞功能實驗方面，沉默MMP-2抑制了宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖能力并促進(jìn)其凋亡；在體外裸鼠成瘤實驗中抑制其皮下成瘤能力及腫瘤生長，而MMP-2很可能通過與VEGF的相互作用促進(jìn)宮頸鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲。MMP-2可能是宮頸鱗癌的“致癌因子”和潛在的治療靶點，為未來靶向治療宮頸鱗癌提供了一定的理論依據(jù)。