煙臺蘋果多酚的提取、分離及純化

李文前 董涵 張肖思睿 張振煒 劉序彥

摘? ?要：為分析煙臺各縣區(qū)7個(gè)示范果園的紅富士蘋果中多酚組成，文章采用微波輔助法提取蘋果中多酚，福林—酚比色法和鐵鹽催化法分別測定總酚及原花青素含量。結(jié)果表明，各鮮果中總酚含量為2.39～3.00 mg/g，原花青素含量占比在總酚中的含量在11.0%～12.4%。其中以煙臺棲霞區(qū)紅富士蘋果為最佳。經(jīng)Sephadex G25精制后蘋果多酚總酚得率為0.25%。煙臺紅富士蘋果多酚含量高，營養(yǎng)豐富，食用和藥用價(jià)值良好。對于煙臺蘋果的深加工和提升附加值具有一定的的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：煙臺蘋果;微波提取;多酚;原花青素

蘋果多酚是植物多酚的一種，是蘋果中所含多元酚類物質(zhì)的通稱，在皮、肉和核中都存在?；瘜W(xué)性質(zhì)和生理功能性質(zhì)穩(wěn)定，可在室溫下長期保存，其易溶于水和乙醇，產(chǎn)品可進(jìn)行深加工，營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值都很高。研究表明蘋果中的酚類物質(zhì)主要包括：類黃酮、綠原酸、兒茶素等。利用“蘋果多酚”的抗氧化作用可以對抗紫外線照射后產(chǎn)生的活性氧的危害，保護(hù)美麗肌膚。另外，對于黑色素生成，肌膚美白也有一定作用。同時(shí)，蘋果多酚化合物還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞的“自殺”作用，抑制細(xì)胞增殖和腫瘤增大，并發(fā)現(xiàn)原花青素是蘋果多酚化合物中抗癌的有效成分，用于牙膏中，既有防蛀齒作用又有潔齒作用，同時(shí)其有抑制高血壓、高血脂及心腦血管疾病的作用，是有效的高血壓、高血脂及心腦血管疾病的制藥劑。被人譽(yù)為是“天然降壓藥”，因此對蘋果多酚的提取、分離及純化方面的研究具有一定的價(jià)值。

我國是重要的蘋果生產(chǎn)國，其中山東煙臺地區(qū)的蘋果栽培歷史悠久，是中國蘋果栽培最早的地方，有140多年的歷史，被稱為中國現(xiàn)代蘋果的發(fā)源地。煙臺氣候和環(huán)境條件非常適宜蘋果生長，被農(nóng)業(yè)部確定為中國蘋果優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，煙臺蘋果以“果形端正、色澤艷麗、果肉甜脆、香氣濃郁”享譽(yù)國內(nèi)外。以煙臺轄區(qū)內(nèi)的長島、龍口、棲霞、萊陽、萊州、蓬萊、招遠(yuǎn)等地栽培的蘋果為煙臺市的區(qū)域公用品牌。但是對煙臺蘋果多酚的進(jìn)一步提取純化及含量研究未見報(bào)道。

因此，本文通過微波提取技術(shù)對煙臺7個(gè)有代表性的縣區(qū)蘋果的多酚及原花青素含量進(jìn)行測定和對比分析，為煙臺蘋果多酚的產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)參考，對于煙臺蘋果的深加工和提升附加值具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1? ? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

山東煙臺紅富士蘋果分別購買于煙臺轄區(qū)內(nèi)的長島、龍口、棲霞、萊陽、萊州、蓬萊、招遠(yuǎn)，編號01—07。陜西洛川紅富士編號08用以做對比。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購買于上海源葉生物科技有限公司、碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、Folin-ciocalteui試劑（自制：在1l磨口回流蒸餾器中加入100 g鎢酸鈉（Na2WO4），25 g鉬酸鈉Na2MoO4），700 mL蒸餾水，50 mL 85%磷酸，100 mL 37%鹽酸（HCl），冷凝回流10 h，然后添加150 g硫酸鋰（Li2SO4）和數(shù)滴溴液（Br2），取下冷凝管，重新加熱至沸，維持15 min，除去多余溴，冷卻后補(bǔ)足蒸餾水至1 000 mL，用棕色試劑瓶裝好，置于冰箱中長期冷藏備用，臨用時(shí)稀釋3倍）。

1.2? 方法

1.2.1? 多酚提取

準(zhǔn)確稱取蘋果渣2.0 g于250 mL錐形瓶中，采用微波提取，提取條件：萃取時(shí)間60 s;功率750 W;乙醇濃度60%;料液比1：50。提取后4 000 r/min，20 min離心，取上層離心液定容到50 mL。

1.2.2? 總酚含量測定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用福林—酚比色法測定蘋果中總酚的含量。

測定方法根據(jù)參考文獻(xiàn)修改如下：準(zhǔn)確稱量干燥至恒重的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0 mL，7.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL棕色容量瓶中，然后分別加入福林—酚試劑1.0 mL，混勻后加入10%碳酸鈉溶液5.0 mL，充分混勻，定容到25 mL，30 ℃遮光反應(yīng)1 h，于765 nm測定吸光值，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.022 5x+0.006 1，R?=0.998 2。

1.2.3? 樣品測定

量取多酚提取液2 mL于25 mL棕色容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，測定蘋果多酚含量。

1.2.4? 蘋果提取物中原花青素含量的測定

將1.2.1中配置好的2 mL多酚提取物，用甲醇溶解后定容至25 mL，然后取1 mL樣液加入具塞試管中，再依次加入6 mL正丁醇/鹽酸溶液（體積比為95/5），0.2 mL硫酸鐵銨溶液（0.024 g/mL），于沸水中加熱40 min后迅速冷卻，以試劑空白作參比，然后在546 nm處測定其吸光度。

1.2.5? 葡聚糖凝膠Sephadex G25預(yù)處理

Sephadex G25屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質(zhì)，適合于不同類型有機(jī)物的分離，并且性質(zhì)穩(wěn)定，易實(shí)施循環(huán)操作。

樣液上柱后用蒸餾水洗脫，流速1 mL/min，每4 min收集一次洗脫液，1～10為水洗液，10管后采用70%的乙醇以0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，每管按照0.5 mL/min的量收集洗脫液，然后逐管分別進(jìn)行多酚的測定。

2? ? 結(jié)果分析

2.1? 總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如圖1所示，煙臺7個(gè)縣區(qū)（01～07）樣果中鮮果蘋果多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.388～2.998 mg/g，與08陜西洛川紅富士蘋果對比分析可知，煙臺紅富士蘋果中總體多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其中棲霞區(qū)蘋果多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為2.998 mg/g。

2.2? 原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如圖2所示，在煙臺紅富士（01—07）蘋果中原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.278～0.372 mg/g，由表3可知原花青素在總酚中的占比為11.0%～12.4%，其中棲霞（03）紅富士總酚中原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到12.4%，陜西洛川（08）紅富士總酚中原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)12.2%。因?yàn)樵ㄇ嗨赜幸欢ǖ目寡趸砸约搬t(yī)用價(jià)值，為煙臺蘋果多酚中單體的提取和純化提供了一定的理論依據(jù)。各區(qū)原花青素在總酚中的占比如表1所示。

2.3? 蘋果多酚的精制

結(jié)果如圖3所示，從中可以看出比較明顯的峰有8個(gè)，其中最早出現(xiàn)的峰多酚含量較少，自18管之后多酚的含量明顯增加，18～42管之間為多酚分布的高峰區(qū)間，合并18管之后的洗脫液進(jìn)行含量測定。經(jīng)Sephadex G25精制后的蘋果多酚，經(jīng)冷凍干燥處理得到產(chǎn)品蘋果多酚粉末，蘋果多酚總酚得率為0.25%。

3? ? 結(jié)語

文章研究了山東煙臺7個(gè)地區(qū)紅富士蘋果的多酚及原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從實(shí)驗(yàn)中可知煙臺區(qū)紅富士蘋果中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.388～2.998 mg/g，原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)占比在總酚中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在11.0%～12.4%，其中棲霞（03）紅富士總酚和原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高分別為2.998 mg/g和12.4%。與洛川（08）紅富士蘋果對比可知，煙臺紅富士因其栽培蘋果歷史悠久，水土、氣候等條件利于蘋果的生長所以其總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于洛川紅富士，但是二者中原花青素含量占比都很高可達(dá)12%左右。經(jīng)Sephadex G25精制后的蘋果多酚總酚得率為0.25%。