油橄欖果渣多酚分離純化及抗氧化活性

謝碧秀 +馬建英 +楊澤身+向亞楠 陳明霜

摘要：研究了6種大孔樹脂對油橄欖果渣多酚的吸附性能，篩選出最佳樹脂為XAD-16，進(jìn)一步對油橄欖果渣多酚的分離純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化。最佳工藝為pH值4的油橄欖果渣多酚提取液濃度為0.3 mg/mL，上樣流速為 2 BV/h，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，洗脫量為3 BV。對純化后的油橄欖果渣多酚抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，油橄欖果渣多酚具有較強(qiáng)的還原能力，對超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽具有良好的清除能力。

關(guān)鍵詞：油橄欖果渣；多酚；純化；抗氧化

中圖分類號：TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0178-05

油橄欖（Olea europaea L.）主產(chǎn)地中海區(qū)域，為著名亞熱帶木本油料兼果用樹種，栽培品種含豐富優(yōu)質(zhì)食用植物油——橄欖油[1]，享有植物油皇后的美譽(yù)[2]。自20世紀(jì)60年代起，油橄欖開始在中國引種，其中，甘肅省隴南市武都區(qū)是目前全國最大的油橄欖種植基地[3]。油橄欖榨油后的果渣、廢水等生產(chǎn)副產(chǎn)物雖然富含多酚、苦苷等活性物質(zhì)，但綜合利用還有待開發(fā)。多酚類化合物廣泛存在于許多植物中，研究證實(shí)，油橄欖多酚對DPPH自由基和羥基自由基都具有一定的清除能力[4-5]。國內(nèi)關(guān)于油橄欖果渣、葉片、果實(shí)中多酚提取方法的研究已有較多報(bào)道[4-10]，但很少看到關(guān)于油橄欖果渣中多酚類物質(zhì)分離純化的報(bào)道。在前期油橄欖多酚提取方法研究的基礎(chǔ)上，使用大孔樹脂對提取液進(jìn)行了分離純化，進(jìn)一步分析了油橄欖果渣多酚的抗氧化活性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

油橄欖果渣由涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司提供，果實(shí)經(jīng)榨油脫水后產(chǎn)生的果渣立即裝袋，真空包裝，-20 ℃ 條件下保藏備用。

1.2試劑與儀器

試劑：蒸餾水；正己烷、無水乙醇、碳酸鈉、Folin-Ciocalteu 試劑等均為分析純，四川成都市科龍化工試劑廠；沒食子酸標(biāo)品，中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；大孔吸附樹脂XAD-7HP、XAD-16，羅門哈斯公司；大孔吸附樹脂AB-8、HPD-200、HP-20、D101，四川成都市科龍化工試劑廠。

儀器：UV-18000紫外可見分光光度儀，翱藝儀器（上海）有限公司；SB-5200超聲波清洗儀，寧波新藝生物科技股份有限公司；ATL-124分析天平，德國賽多利斯集團(tuán)；DUG-924GA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；玻璃層析柱，16 mm×30 mm；HL-2恒流泵，上海青浦滬西儀器廠。[LM]

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1多酚提取濃縮物的制備

精確稱取10 g經(jīng)解凍后的果渣，以80%乙醇，料液比1 ∶[KG-*3]24，在250 W、50 ℃的水浴中超聲45 min，收集上清液，于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到棕紅色的粗提液；將粗提液用25 mL正己烷萃取2次，正己烷層濃縮，回收正己烷，得油橄欖果渣提取物精制產(chǎn)品，并于 -20 ℃ 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2多酚含量測定

采用Folin-Cilcalteu比色法[11]在765 nm波長處測定不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)，得到回歸方程式y(tǒng)=5.169 7x（r2=0.999 0），沒食子酸標(biāo)品在0～0.275 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。以試樣替代沒食子酸溶液測定吸光值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量（以沒食子酸計(jì)）。

1.3.3樹脂篩選

通過測定7種樹脂的吸附和解吸能力確定最佳樹脂。準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理，并經(jīng)濾紙吸干后的6種樹脂各2.000 g，分別置于250 mL具塞磨口三角瓶中，加入濃度為0.25 mg/mL的多酚粗提液40 mL，水浴振蕩，（25 ℃、120 r/min）24 h后，過濾取上清液測定濾液體積和多酚的濃度，計(jì)算吸附率。將濾出的樹脂加入80%的乙醇40 mL繼續(xù)振蕩8 h，計(jì)算解吸率。

1.3.5吸附動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

1.3.5.1pH值對吸附的影響

將最佳大孔樹脂濕法裝入5根相同型號的層析柱中，柱體積10 mL。將20 mL濃度為 0.25 mg/mL 的多酚提取液在pH值分別為3、4、5、6、7的條件下上柱，上柱速率為2 BV/h，以確定最佳pH值。

1.3.5.2上樣流速對吸附的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱。然后將濃度為0.25 mg/mL、pH值4的多酚提取液20 mL用恒流泵分別以1、2、3、4、5 BV/h的速率上柱吸附，以確定最佳上樣流速。

1.3.5.3上樣濃度對吸附的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱。分別用20 mL pH值4，濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的多酚提取液上柱，流速為3 BV/h，以確定最佳上樣濃度。

1.3.6解析動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

1.3.6.1乙醇濃度對洗脫效果的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱，按優(yōu)選吸附條件進(jìn)行上樣吸附，收集流出液并測多酚含量；蒸餾水淋洗，然后分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，以3 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，洗脫體積為3 BV，以確定乙醇的最佳洗脫濃度。

1.3.6.2洗脫劑體積對洗脫效果的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱，按優(yōu)選吸附條件進(jìn)行上樣吸附，收集流出液并測多酚含量；蒸餾水淋洗，80%乙醇分別以1、2、3、4、5 BV 的量進(jìn)行洗脫，以確定乙醇洗脫的最佳體積。

1.3.6.3動(dòng)態(tài)洗脫曲線的繪制

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱，將20 mL多酚提取液按優(yōu)選吸附條件上柱吸附，再用蒸餾水淋洗樹脂，用80%乙醇以3 BV/h的速率洗脫，收集洗脫液每2 mL測1次多酚濃度，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.3.7抗氧化活性測定

1.3.7.1還原力的測定[12]

在2.5 mL pH值6.6磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的試樣溶液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒溫20 min后，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，然后以3 000 r/min離心分離10 min，取上清液5 mL加蒸餾水5 mL、0.1% FeCl3溶液1 mL，在700 nm處測定吸光度。以蒸餾水為無還原能力對照，維生素C、BHT作為還原能力對照。

1.3.7.2對超氧陰離子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）的清除作用[13]

取4.5 mLTris-HC1緩沖溶液，于25 ℃水浴中放置20 min，分別加入1 mL不同濃度的試驗(yàn)溶液和0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，然后加入 8 mmol/L 的HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，然后在420 nm處測定吸光度D1，空白以蒸餾水代替樣品液，測定吸光度D0。按下式計(jì)算清除率：

[JZ] O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率=（D0-D1）/D0×100%。

1.3.7.3橄欖多酚提取物亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用[14-15]

取不同濃度的樣品液3 mL于具塞試管中，用pH值3.0的檸檬酸緩沖液定溶至5 mL，然后每管中加入 5 μg/mL 亞硝酸鈉1 mL，混勻，立即置于37 ℃水浴中保溫 1 h，隨后立即向各反應(yīng)管加入0.4%的對氨基苯磺酸1 mL，混勻，靜置5 min；再向各管加入0.2%的鹽酸萘乙二胺顯色劑0.5 mL，搖勻，定容至10 mL，靜置15 min。每樣品管同時(shí)做不加亞硝酸鈉的本色管（空白管），并做亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)管（不加樣品，其余相同），分別測各管在538 nm處的吸光度D值。按下式計(jì)算清除率：

[JZ]NaNO2清除率=[D標(biāo)-（D樣-D空）]/D標(biāo)×100%。

式中：D標(biāo)為不加待測樣只加了NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液和其他試劑的反應(yīng)管光密度；

D樣為既加待測樣又加了NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液和其他試劑的反應(yīng)管光密度；

D空為只加待測樣和其他試劑不加NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液的的反應(yīng)管光密度。

以上試驗(yàn)，每個(gè)試樣做3次平行。

2結(jié)果與分析

2.1樹脂的篩選

大孔吸附樹脂的吸附實(shí)質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果；同時(shí)由于大孔吸附樹脂的多孔性結(jié)構(gòu)使其對分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用[16-17]，酚類化合物的分子中含有多個(gè)酚羥基，分子極性并不太高，因此在弱極性和非極性樹脂上吸附的效果更好[18]。從圖1可以看出，D101吸附率最低；HPD-200雖然吸附率最高，但解吸率卻最低；HP-20吸附率第2，解吸率是倒數(shù)第2；XAD-7HP、XAD-16、AB-8的吸附率都較高，其中以 XAD-16最高，所以選XAD-16為最佳吸附樹脂。

2.2最佳大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析曲線

可以看出，XAD-16樹脂對油橄欖果渣多酚的靜態(tài)吸附率隨著吸附時(shí)間的延長而提高，1 h時(shí)的吸附率即可達(dá)到78.94%，表明XAD-16的吸附效率高。

可以看出，在0.5 h的解吸時(shí)間內(nèi)，多酚解吸率迅速達(dá)到84.64%，超過2 h后，隨著吸附時(shí)間的延長，解吸率變化趨于平緩，表明80%的乙醇溶液經(jīng)過2 h就能把油橄欖果渣多酚很好地從大孔樹脂XAD-16中解吸出來，解吸時(shí)間短，解吸率高，最高可達(dá)88.45%。

2.3吸附動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

2.3.1pH值對吸附的影響

pH值對物質(zhì)吸附的影響主要取決于化合物的酸堿度，酸性化合物在酸性溶液中易被吸附，堿性化合物在堿性條件下易被吸附[19]。從圖4可以看出，隨著pH值的升高，XAD-16樹脂對油橄欖果渣多酚的吸附率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，并在pH值為4時(shí)達(dá)到最大值。這可能與多酚類物質(zhì)屬于帶羥基的多元酚酸類有關(guān)，在微酸性環(huán)境下，酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不易被破壞，以分子態(tài)存在，易于被識別并吸附[20]；在溶液pH值較高條件下，多酚化合物的酚羥基會(huì)解離形成H+，并產(chǎn)生相應(yīng)的陰離子，進(jìn)而削弱溶液中氫鍵間的相互作用力，最終導(dǎo)致樹脂的吸附能力隨之下降[14]。因此，樣液的pH值調(diào)為4最佳。

[FK（W11][TPXBX4.tif][FK）]

2.3.2上樣流速對吸附的影響

上樣流速對樹脂吸附的影響主要是溶質(zhì)向樹脂表面的擴(kuò)散作用，對于相同濃度的上樣溶液，上樣流速過大，樹脂的吸附率就會(huì)降低。上樣流速過小，多酚分子雖然能夠充分與樹脂接觸，但吸附時(shí)間太長，不適用于生產(chǎn)。從圖5可以看出，上樣流速越快，XAD-16樹脂對油橄欖果渣多酚的吸附率逐漸降低，在上樣流速為1 BV時(shí)，吸附率為98.29%；在上樣流速為2 BV時(shí)，吸附率為 98.14%。既要使大孔吸附樹脂的吸附效果好，又要保證較高的工作效率，綜合考慮采用2 BV的上樣流速較為適宜。

2.3.3上樣濃度對吸附的影響

從圖6可以看出，隨著上樣濃度的增加，吸附率隨之升高；當(dāng)濃度達(dá)到0.3 mg/mL時(shí)，吸附率達(dá)到最高值98.36%；超過0.3 mg/mL濃度后，吸附率稍有下降。根據(jù)吸附平衡理論，濃度減小，達(dá)到平衡時(shí)所需提液體積增大，殘留在流出液中的多酚增多，吸附率降低；濃度過高時(shí)，樹脂表面的多酚分子單分子層吸附飽和后，會(huì)發(fā)生多層吸附，并容易產(chǎn)生絮凝和沉淀，堵塞微孔，降低內(nèi)孔利用率，吸附率也將下降[19，21]。因此，上樣濃度控制在 0.3 mg/mL 為宜。

2.4解析動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

2.4.1乙醇濃度對洗脫效果的影響

從圖7可以看出，在一

定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，樹脂對油橄欖果渣多酚的解吸率逐漸提高，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值 97.82%，繼續(xù)提高乙醇的濃度，解吸率反而有所下降。因?yàn)橐掖紳舛冗^低時(shí)，解吸液的極性較高，不僅不能破壞樹脂與多酚間形成的氫鍵，而且多酚在解吸液中的溶解性低，解吸率也低；當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，油橄欖果渣多酚提取液中的大分子物質(zhì)沉淀會(huì)使樹脂中多酚分子擴(kuò)散困難，同時(shí)水溶性多酚的溶解量降低而導(dǎo)致解吸率降低。因而選用80%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。

2.4.2洗脫劑的體積對洗脫效果的影響

洗脫劑乙醇體積對油橄欖果渣多酚洗脫效果的影響見圖8。從圖8可以看出，隨著乙醇用量的增加，多酚的解吸率也隨之增加，在洗脫體積為3 BV后效果增加不明顯。綜合考慮選擇洗脫劑乙醇的用量為3 BV為宜。

2.4.3動(dòng)態(tài)洗脫曲線的繪制

XAD-16樹脂的動(dòng)態(tài)洗脫曲線見。油橄欖果渣多酚洗脫峰相對集中，較容易洗脫。流出液體積達(dá)到4 mL時(shí)開始有多酚流出；隨著流出液體積增加，洗脫液中多酚濃度快速上升，當(dāng)流出液體積達(dá)到8 mL左右，多酚濃度達(dá)到最大值0.58 mg/mL；隨后流出液體積再增加，多酚濃度降低。當(dāng)洗脫液達(dá)30 mL時(shí)，洗脫基本完成，因此，選用3 BV的洗脫體積，可使洗脫液中的多酚含量達(dá)到最大。

2.5抗氧化活性測定

2.5.1還原力的測定

多數(shù)非酶類抗氧化劑是通過還原反應(yīng)終止氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的，所以，化合物的還原能力是顯示其是否具有抗氧化潛能的重要因素[14]。由K3Fe（CN）6反應(yīng)成K4Fe（CN）6，并進(jìn)一步生成Fe4[Fe（CN）6]3，這是一有色反應(yīng)的過程，在700 nm波長處有最大吸收峰，吸光度越大則樣品的還原力越強(qiáng)[22]。油橄欖果渣多酚與維生素C、BHT還原力的比較見圖10。從圖10可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，試樣的還原力隨著濃度的增加均呈上升變化趨勢；油橄欖果渣多酚的還原力低于維生素C，高于BHT，表明油橄欖果渣多酚具有較強(qiáng)的還原能力。

超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)氧代謝首先形成的自由基，是所有氧自由基的前身，在某些病理情況下，機(jī)體內(nèi) O-2[KG-*2]· [KG-*3]產(chǎn)生過多或清除能力減弱，使體內(nèi) O-2[KG-*2]· [KG-*3]濃度升高，就會(huì)產(chǎn)生氧化損傷而誘發(fā)多種疾病[23]，因此，在檢驗(yàn)物質(zhì)的抗氧化活性時(shí)常把清除超氧陰離子自由基作為重要指標(biāo)之一。以維生素C、BHT為對照，測定油橄欖多酚對超氧陰離子自由基的清除率見圖11。油橄欖果渣多酚對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，但其清除能力比維生素C、BHT的要弱。當(dāng)濃度為0.1～0.3 mg/mL時(shí)，油橄欖果渣多酚對超氧陰離子自由基的清除率從5.17%迅速增至51.86%，隨后隨著樣品濃度的繼續(xù)增加而清除率變化幅度不大，在濃度為0.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值63.64%。

2.5.3油橄欖多酚提取物亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用

N-[CM（24*5]亞硝基化合物是一種具有強(qiáng)烈致癌作用的化合物，其前

提物質(zhì)廣泛存在于食品中以及產(chǎn)生于食物在體內(nèi)的代謝中，硝酸鹽或亞硝酸鹽和胺類可在體內(nèi)合成亞硝胺，尤其在胃液中更易合成[24]，是誘發(fā)胃癌的重要因素。以維生素C、BHT為對照，研究油橄欖多酚對亞硝酸鹽的清除作用，試驗(yàn)結(jié)果見圖12。在同樣濃度條件下，油橄欖果渣多酚對于亞硝酸鹽的清除能力低于維生素C、BHT。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，油橄欖果渣多酚對亞硝酸鹽的清除作用隨著試樣濃度的增加而提高，清除率最大值為濃度在0.5 mg/mL時(shí)的52.27%。

3結(jié)論

通過對6種大孔樹脂吸附分離性能的考察，篩選出最佳樹脂為XAD-16。進(jìn)一步對油橄欖果渣多酚的分離純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化：上柱條件為油橄欖果渣多酚提取液濃度 0.3 mg/mL，最佳pH值為4，上樣流速為2 BV/h。解吸條件為洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，洗脫量為3 BV。采用大孔樹脂分離油橄欖果渣多酚具有吸附容量大、選擇性好、易于解吸、機(jī)械強(qiáng)度高、再生處理簡單、操作簡單、得率恒定、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、成本低等特點(diǎn)。

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，油橄欖果渣多酚具有良好的抗氧化能力，其還原力低于維生素C，高于BHT；油橄欖果渣多酚濃度在0.5 mg/mL時(shí)對超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽的清除率分別為63.64%、52.27%，表現(xiàn)出良好的清除效果。

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