食品大腸菌群間接計(jì)數(shù)法在水質(zhì)大腸菌群監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用效果

趙衛(wèi)紅　徐秋琴　裴擁軍　毛云斌　黃曾　鄒錦群　詹卓蓬

[摘要]目的 探討GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》中的間接計(jì)數(shù)法（MPN法）檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的效果。方法 采集2017年10月～2018年4月豐城市城市生活飲用水、農(nóng)村生活飲用水、水庫水、水源水等各類水質(zhì)，利用GB 4789.3-2016中的MPN法與GB/T 5750.12-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》中的總大腸菌群MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群，驗(yàn)證兩種方法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的關(guān)聯(lián)性，比較分析兩種方法檢測(cè)每項(xiàng)陽性樣本所花費(fèi)的人力、物力、費(fèi)用、時(shí)間以及大腸菌群陽性率。結(jié)果 兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的一致性較好（Kappa=0.97）;兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;食品大腸菌群MPN法的儀器耗損費(fèi)、試劑費(fèi)用、消耗人力費(fèi)用均低于水質(zhì)大腸菌群MPN法，消耗時(shí)間短于水質(zhì)大腸菌群MPN法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 食品大腸菌群MPN法可替代水質(zhì)大腸菌群MPN法用于水質(zhì)大腸菌群的檢測(cè)，可大大節(jié)省人力、物力、財(cái)力。

[關(guān)鍵詞] GB 4789.3-2016間接計(jì)數(shù)法;GB/T 5750.12-2006間接計(jì)數(shù)法;人力消耗;物力消耗;時(shí)間消耗

[中圖分類號(hào)] R123.1 ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）3（b）-0159-04

Application effect of food coliform indirect counting method in water quality coliform monitoring

ZHAO Wei-hong? ?XU Qiu-qin? ?PEI Yong-jun? ?MAO Yun-bin? ?HUANG Zeng? ZOU Jin-qun? ?ZHAN Zhuo-peng

Department of Clinical Laboratory， Fengcheng Center for Disease Control and Prevention in Jiangxi Province， Fengcheng? ?331100， China

[Abstract] Objective To explore the effect of indirect counting method （MPN method） in GB 4789.3-2016 "National Food Safety Standard for food microbiology test—Coliforms Count" on detecting coliforms in water. Methods The water samples were inciuded urban drinking water， rural drinking water， reservoir water， and water source from Fengcheng city from October 2017 to April 2018. The coliforms in water were detected by the MPN method in GB 4789.3-2016 and the total coliforms MPN method in GB/T 5750.12-2006 "Standard examination methods for drinking water—Microbilolgical parameters"， separately. The correlation between the two methods for detecting coliform bacteria was verified. The manpower， material resources， cost， time and the positive rate of coliform bacteria detected by the two methods were compared. Results The consistency of two MPN methods to detect coliform group in water quality was good （Kappa=0.97）. There was no significant difference in the positive rate of coliform detected by two MPN methods （P>0.05）. The instrument cost， reagent cost and labor cost of food coliform group MPN method were lower than those of water coliform group MPN method， and the consumption time was shorter than that of water coliform group MPN method， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion MPN method of food coliform group can replace MPN method of water coliform group to detect coliform group of water quality， which can greatly save manpower， material and financial resources.

[Key words] GB 4789.3-2016 indirect counting method; GB/T 5750.12-2006 indirect counting method; Labor consumption; Material consumption; Time consumption

大腸菌群為水質(zhì)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)的指示菌[1]，實(shí)現(xiàn)其快速檢測(cè)具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義。目前，對(duì)于大腸菌群快速檢測(cè)的方法大部分是基于對(duì)其核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)，這些技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求高，價(jià)格昂貴，因此限制了其應(yīng)用[2]。目前普遍采用的水質(zhì)大腸菌群間接計(jì)數(shù)法（MPN法）較食品大腸菌群MPN法操作步驟多，繁雜，且工作量較大[3]。本研究將食品大腸菌群MPN法用于水質(zhì)大腸菌群的檢測(cè)，驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn)驗(yàn)證大腸菌群的檢測(cè)效果，對(duì)照水質(zhì)大腸菌群MPN法的檢測(cè)時(shí)間、消耗的人力、物力以及大腸菌群檢出率，旨在探討食品大腸菌群MPN法用于水質(zhì)大腸菌群檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1樣本與試劑

采集2017年10月～2018年4月豐城市城市生活飲用水、農(nóng)村生活飲用水、水庫水、水源水等各類水質(zhì)，試劑包括：乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、革蘭染色液、伊紅美藍(lán)瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯（青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司）。

1.2儀器與設(shè)備

YC-180澳柯瑪冰箱（澳柯瑪股份有限公司）、 JM-A電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、CJV1500T潔凈工作臺(tái)（山東新華醫(yī)療器械廠）、LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠）、5V電動(dòng)移液槍（DLAB Scientific Inc）。

1.3方法

1.3.1檢測(cè)前準(zhǔn)備? 高壓滅菌消毒采水容器，將水樣本置入容器中，在6 h內(nèi)送到檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2水質(zhì)大腸菌群檢測(cè)方法? 采用GB/T5750.12-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》中的總大腸菌群MPN法。用滅菌吸管取10 ml水樣接種到10 ml雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，用滅菌吸管取1 ml水樣接種到10 ml單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1 ml水樣加到9 ml生理鹽水中混勻，用1 ml滅菌吸管注入到10 ml單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管，總共15管。

將接種管置于（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)（24±2）h，如有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣管，分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，于（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，符合深紫黑色，有金屬光澤;紫黑色帶或略帶金屬光澤;淡紫紅色，中心較深的菌落，做革蘭染色、鏡檢、證實(shí)實(shí)驗(yàn)。計(jì)大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN表得出大腸菌群最可能數(shù)（MPN）值。

1.3.3食品大腸菌群檢測(cè)方法? 采用GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)? 大腸菌群計(jì)數(shù)》中的MPN法檢測(cè)。用滅菌吸管取10 ml水樣接種到10 ml LST肉湯管培養(yǎng)液中，用滅菌吸管取1 ml水樣接種到10 ml LST肉湯管培養(yǎng)液中，另取1 ml水樣加到9 ml生理鹽水中混勻，用滅菌吸管取1 ml水樣接種到10 ml LST肉湯管培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種3管，總共9管。

將接種管置于（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24～48 h，產(chǎn)氣管進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于BGLB肉湯管中，（36±1）℃培養(yǎng)（48±12） h，計(jì)大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN表得出大腸菌群MPN值。

1.3.4兩種方法的一致性檢驗(yàn)? 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)Kappa檢驗(yàn)驗(yàn)證GB 4789.3-2016中的MPN法與GB/T 5750.12-2006中的總大腸菌群MPN法檢測(cè)水質(zhì)中大腸菌群的一致性，證明兩種方法均能用于水質(zhì)中大腸菌群的檢測(cè)。

1.4觀察指標(biāo)

比較兩種方法檢測(cè)每項(xiàng)陽性樣本所花費(fèi)的人力、物力、費(fèi)用、時(shí)間，評(píng)價(jià)兩種方法大腸菌群的檢測(cè)效果，并分析兩種方法檢測(cè)的大腸菌群陽性率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;采用Kappa值檢驗(yàn)一致性，Kappa≥0.75提示一致性較好。

2.結(jié)果

2.1兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的一致性

兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的一致性較好（Kappa=0.97）（表1）。

2.2兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群陽性率的比較

兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.3兩種MPN法所耗成本的比較

食品大腸菌群MPN法的儀器耗損費(fèi)、試劑費(fèi)用、消耗人力費(fèi)用均低于水質(zhì)大腸菌群MPN法，消耗時(shí)間短于水質(zhì)大腸菌群MPN法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

3討論

大腸菌群是公認(rèn)的水質(zhì)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌[4-5]，便利、快速、廉價(jià)的檢測(cè)方法對(duì)確保水質(zhì)的衛(wèi)生至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于大腸菌群快速檢測(cè)方法很多，這些方法包括核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及其衍生技術(shù)、基于16SrRNA與GyaB的檢測(cè)技術(shù)[1]、化二硫化鉬（MoS2）納米片的光纖表面等離子體共振免疫傳感器快速檢測(cè)技術(shù)[6]、流式細(xì)胞阻抗儀檢測(cè)[7]、組合的單砷化丙啶染色和定量PCR檢測(cè)[8]、智能手機(jī)的凝膠環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)（gLAMP）系統(tǒng)[9]、人類致病菌下一代測(cè)序[10]、氯酚的生物降解[11]、生物物傳感器蛋白子彈快速檢測(cè)飲用水中大腸桿菌的熒光方法[12]、快速檢測(cè)體細(xì)胞噬菌體的方法（Bluephage法）[13]、濃縮和免疫檢測(cè)法[14]等，這些方法快捷、精確，但需要高精儀器與設(shè)備，費(fèi)用也非常昂貴，不適宜在基層疾控中心應(yīng)用。

一般水質(zhì)大腸菌群檢測(cè)，常規(guī)采用國(guó)標(biāo)GB/T 5750.12-2006中的MPN檢測(cè)方法，但此法耗費(fèi)的人力、物力很高、時(shí)間較長(zhǎng)。本研究采用食品國(guó)標(biāo)GB 4789.3-2016中的MPN檢測(cè)方法，用于檢測(cè)水質(zhì)的大腸菌群，經(jīng)過兩種方法檢測(cè)大腸菌群的關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的一致性較好（Kappa=0.97），提示兩種方法均能用于大腸菌群的檢測(cè)，且通過兩種方法大腸菌群的檢出率對(duì)比分析，結(jié)果顯示，兩種MPN法檢測(cè)水質(zhì)大腸菌群的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示食品大腸菌群MPN法用于水質(zhì)大腸菌群的檢測(cè)有一定的可行性。本研究結(jié)果還顯示，食品大腸菌群MPN法的儀器耗損費(fèi)、試劑費(fèi)用、消耗人力費(fèi)用均低于水質(zhì)大腸菌群MPN法，消耗時(shí)間短于水質(zhì)大腸菌群MPN法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示食品大腸菌群MPN法具有較好的經(jīng)濟(jì)及時(shí)間效益[15]。

綜上所述，兩種方法檢出的大腸菌群陽性率基本一致，而GB/T 5750.12-2006中的MPN檢測(cè)方法需要比食品GB 4789.3-2016中的MPN檢測(cè)方法更多的人力、物力、財(cái)力，且操作繁瑣，花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。因此，基層疾控單位采用食品GB 4789.3-2016中的MPN法替代GB/T 5750.12-2006中的MPN法檢測(cè)水質(zhì)中的大腸菌群，可以因地制宜、操作方便、節(jié)省開支與時(shí)間。

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（收稿日期：2019-07-23? 本文編輯：閆? 佩）