多壁碳納米管凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定香蕉中8種新煙堿類殺蟲劑

樂淵 鄧正敏 劉春華 吳南村

摘要：建立基于多壁碳納米管凈化、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量的分析方法。香蕉樣品中用含1%乙酸的乙腈提取后，經(jīng)多壁碳納米管凈化后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的質(zhì)量濃度在0.005～0.200 mg/L范圍內(nèi)線性良好，最低檢出限在0.03～0.44 μg/kg 之間，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，平均加標(biāo)回收率在75.2%～114.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)差在0.3%～9.5%之間。與N-丙基乙二胺和石墨化碳黑吸附劑相比，多壁碳納米管具有凈化效果好和效率高等優(yōu)點。方法學(xué)考察及實際樣品的測定證明該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量的檢測。

關(guān)鍵詞：香蕉;新煙堿類殺蟲劑;多壁碳納米管;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;加標(biāo)回收率;殘留量

中圖分類號：S481+.8?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0181-05

收稿日期：2018-11-22

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-31-13）;熱帶農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全科技創(chuàng)新團隊項目（編號：1630082017002）。

作者簡介：樂?淵（1985—），男，江西撫州人，碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail：leyuan06@sina.com。

新煙堿類殺蟲劑作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜的煙堿乙酰膽堿受體及其周圍的神經(jīng)，使昆蟲保持興奮、麻痹而后死亡[1]，由于具有高效率、高選擇性、高持效性和對哺乳動物低毒等特點而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在香蕉生產(chǎn)中也可用于防治薊馬、紅蜘蛛、夜蛾、香蕉象甲等害蟲[2-3]。近年來研究表明，新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂、家蠶和蚯蚓等非靶標(biāo)生物存在較大毒性，且在香蕉生產(chǎn)過程中過量使用或濫用殺蟲劑會造成果實中存在農(nóng)藥殘留，易引發(fā)生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題[4-6]。因此，開發(fā)香蕉中新煙堿類殺蟲劑分析方法對于保障香蕉產(chǎn)品質(zhì)量安全和消費者健康具有重要意義。

美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades等開發(fā)的QuEChERS方法是目前各實驗室中常用的農(nóng)藥多殘留分析的前處理方法，包含液液萃取和微型的固相分散萃取等2個步驟[7]。QuEChERS方法的優(yōu)點是效率高、適用性好和有機溶劑使用量少，但也存在凈化能力弱的缺點。為改善QuEChERS方法的凈化能力，在常用的N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）和石墨化碳黑（GCB）等吸附材料之外，研究新吸附材料成為熱點。多壁碳納米管（MWCNTs）憑借比表面積大、吸附性能好等優(yōu)點受到研究者的關(guān)注，并被應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域[8-10]。本研究采用多壁碳納米管作為吸附材料，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的可分析農(nóng)藥范圍廣、靈敏度高和選擇性好等特點，探討建立測定香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的改進(jìn)型QuEChERS方法。

1?材料與方法

1.1?儀器與試劑

主要的試驗儀器有TripleQuad 4500超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源（ESI）和Analyst 1.6.3工作站（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、ACQUITY_ UPLCTM BEH C18 1.7 μm×2.1 mm×50 mm 色譜柱[沃世特科技（上海）有限公司]、AL204型電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]、VS-24SMTi型離心機（美國VISION公司）。

主要的試劑有呋蟲胺、烯啶蟲胺、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻蟲胺、啶蟲脒、氟啶蟲胺腈、噻蟲啉等8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，純度≥99%）;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（美國Fisher公司，色譜純）;多壁碳納米管（天津博納艾杰爾科技有限公司）外徑為10～20 nm，內(nèi)徑為5 nm，長度為5～15 μm，使用前在120 ℃下加熱3 h去除殘留的水份;石墨化碳黑吸附劑（GCB）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）（美國安捷倫科技公司）;乙酸銨、乙酸鈉、氯化鈉（廣州化學(xué)試劑廠）;無水硫酸鎂[西格瑪-奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司];檸檬酸鈉和檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（上海阿拉丁生物科技股份有限公司）;試驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)0.22 μm過濾膜過濾的純化水;香蕉樣品購自本地超市和水果批發(fā)市場。

1.2?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1?儲備液的配制?將呋蟲胺等8種農(nóng)藥用乙腈配制成濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18 ℃下避光保存，有效期為1個月。

1.2.2?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制?將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋成濃度為0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取空白香蕉樣品按1.3方法進(jìn)行前處理，得到空白香蕉基質(zhì)溶液。氮吹至近干后，用1 mL相應(yīng)濃度乙腈配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液定容，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3?樣品前處理

香蕉樣品（分為全蕉和蕉肉2份）用組織搗碎機搗碎，裝入潔凈容器內(nèi)，作為試樣密封并于-18 ℃ 下保存。

準(zhǔn)確稱取10.00 g均質(zhì)試樣于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙腈（含1%乙酸）、1.0 g乙酸鈉、4.0 g無水硫酸鎂和1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min。然后以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液1.00 mL于預(yù)先稱有5 mg多壁碳納米管和150 mg無水硫酸鎂的15 mL離心管中，渦旋1 min，再以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。上清液經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯微孔膜過濾，待超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）分析。

1.4?儀器工作條件

超高效液相色譜工作條件：流動相A為水，流動相B為甲醇;柱溫為35 ℃;樣品室溫度為15 ℃;進(jìn)樣體積為3 μL;流速為0.25 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜工作條件：離子源電噴霧;離子化電壓為5 500 V;溫度為500 ℃;氣簾氣壓力為207 kPa;噴霧氣壓力為379 kPa;輔助加熱氣壓力為379 kPa;碰撞氣壓力為55 kPa。多反應(yīng)監(jiān)測模式下的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2?結(jié)果與分析

2.1?UPLC-MS/MS工作條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源電離模式下，以流動注射方式分別對呋蟲胺等8種殺蟲劑的單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子全掃描，再對各自的子離子進(jìn)行全掃描，每個化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量及定性離子對，并進(jìn)行質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表2。

在上述質(zhì)譜條件下，測試甲醇-0.02%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液、乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液、甲醇-2 mmol/L 氨水溶液、甲醇-水等5種流動相體系。結(jié)果表明，當(dāng)使用乙腈作為有機相時，大部分化合物色譜分離度不理想，集中在2～3 min時間段內(nèi)出峰。當(dāng)使用甲醇-水流動相體系時各化合物的分離度較好且響應(yīng)值最高，其中吡蟲啉、呋蟲胺、烯啶蟲胺和噻蟲啉較甲醇-甲酸水溶液和甲醇-乙酸銨水溶液體系提高約3倍。因此，本試驗采用甲醇-水作為流動相。圖1為MRM模式下0.05 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流色譜。

2.2?提取條件的選擇

由于乙腈的通用性強，對農(nóng)藥的溶解度大，試驗選擇乙腈作為提取溶劑。為改善一些對pH值較為敏感的農(nóng)藥的檢測，QuEChERS方法中常加入醋酸鹽緩沖體系或檸檬酸鹽緩沖體系[11-12]。試驗嘗試了在提取過程中加入上述2種緩沖鹽體系，與純乙腈溶液作為參照，對提取效率進(jìn)行比較。試驗在香蕉空白樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加量為50 μg/kg），提取后不經(jīng)凈化直接用UPLC-MS/MS測定。條件1：提取溶劑為純乙腈，后加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉;條件2：提取溶劑為含1%乙酸的乙腈溶液，后加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g 乙酸鈉;條件3：提取溶劑為乙腈，后加入4.0 g 無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉、1.0 g二水檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物。結(jié)果表明，條件2的8種殺蟲劑的提取效率最高，呋蟲胺和烯啶蟲胺比條件1高約50%，比條件3高20%;其他6種殺蟲劑比條件2、3高約10%。因此，本試驗選擇添加醋酸鹽緩沖體系的乙腈作為提取條件。

2.3?凈化條件的選擇

為考察MWCNTs、PSA和GCB對香蕉提取液的凈化效果，分別取1 mL香蕉提取液，用3種條件進(jìn)行凈化：（1）5 mg MWCNTs+150 mg無水硫酸鎂;（2）50 mg PSA+150 mg無水硫酸鎂;（3）10 mg GCB+150 mg無水硫酸鎂。參照文獻(xiàn)[13]對色素凈化效果進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2所示。PSA對色素幾乎無凈化效果，10 mg GCB凈化了96%的葉黃素和全部的葉綠素，5 mg MWCNTs凈化了99%的葉黃素和全部的葉綠素。與GCB相比，MWCNTs比表面積更大，還具有中空結(jié)構(gòu)，凈化效率更高。因此，本試驗選擇5 mg MWCNTs+150 mg無水硫酸鎂作為凈化條件。

2.4?方法的線性范圍和檢出限

按“1.2.2”節(jié)配制一系列濃度的呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑香蕉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用“1.4”節(jié)中的方法進(jìn)行測定，以儀器響應(yīng)值峰面積對各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的質(zhì)量濃度在0.005～0.200 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表3。

以滿足方法學(xué)要求的最低添加回收水平作為定量限，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑在全蕉和蕉肉中的定量限均為5 μg/kg。檢出限采用樣品加標(biāo)方式測定并計算，加標(biāo)樣品經(jīng)“1.3”節(jié)處理后測定，以8種殺蟲劑檢測信號為3倍基線噪音時的添加濃度為方法檢出限，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的檢出限見表3。

2.5?方法的精密度和回收率

取空白香蕉樣品，按5、10、50 μg/kg 3個水平進(jìn)行加標(biāo)試驗，按“1.3”節(jié)進(jìn)行前處理，平行測定6次，作回收率和精密度試驗。結(jié)果（表4）表明，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑在全蕉中平均回收率在80.2%～114.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)差在0.3%～3.5% 之間;在蕉肉中平均回收率在75.2%～102.0% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)差在0.5%～9.5%之間;均滿足NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》中農(nóng)藥殘留分析方法要求[14]。

2.6?基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品分析液中除分析物以外的共流出組分改變了分析物的響應(yīng)值，從而影響定量分析的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，其機制可能是共流出組分影響了電噴霧接口的離子化效率[15]。通過測定呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑在香蕉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中校正曲線的斜率（A）及其在純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液中校正曲線的斜率（B），得到基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，簡稱ME）=（A-B）/B×100%。若ME>0，則表示基質(zhì)對分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強效應(yīng);若ME<0，則表示基質(zhì)對分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制效應(yīng);若ME=0，則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)-20%≤ME≤20%時，基質(zhì)干擾程度較低;當(dāng)-50%≤ME<-20% 或20%50%，表示基質(zhì)干擾程度強烈[16]。表5為香蕉基質(zhì)中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的基質(zhì)效應(yīng)。

結(jié)果表明，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。在全蕉中，噻蟲啉干擾程度較低，啶蟲脒、噻蟲嗪、呋蟲胺、烯啶蟲胺和氟啶蟲胺腈等5種殺蟲劑表現(xiàn)為中等程度的基質(zhì)干擾效應(yīng)，吡蟲啉、噻蟲啉基質(zhì)效應(yīng)干擾強烈。在蕉肉中，8種新煙堿類殺蟲劑基質(zhì)干擾程度均較低。

為消除基質(zhì)效應(yīng)所帶來的干擾，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，常采用標(biāo)準(zhǔn)加入法、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、使用分析保護(hù)試劑和同位素內(nèi)標(biāo)法等[17-18]。在農(nóng)藥殘留分析中，最常見的是用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行消除。從分析結(jié)果可知，當(dāng)只須要測定全蕉中噻蟲啉和蕉肉中8種新煙堿類殺蟲劑時，由于基質(zhì)效應(yīng)較弱可直接使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量;當(dāng)須要測定全蕉中其他7種新煙堿類殺蟲劑時，就須要使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，才能定量準(zhǔn)確。

2.7?實際樣品的測定

采用本試驗建立的方法測定采集于本地4個超市和1個水果批發(fā)市場的15份香蕉樣品。其中2份全蕉樣品檢出啶蟲脒，含量分別為0.040、0.012 mg/kg，均低于《GB 2763—2016?食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品中農(nóng)藥殘留最大限量》中規(guī)定的最大殘留限量值2 mg/kg[19]。相應(yīng)的蕉肉樣品中啶蟲脒為未檢出，表明啶蟲脒主要殘留于香蕉果皮中。其他樣品均未檢出呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑。

3?結(jié)論

本研究建立一種基于多壁碳納米管的凈化方法，結(jié)合UPLC-MS/MS的高分辨能力來快速檢測香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量。與N- 丙基乙二胺和石墨化碳黑等吸附劑相比，多壁碳納米管具有色素凈化效果好、效率高等優(yōu)點。本試驗優(yōu)化了超高效液相色譜與質(zhì)譜的采集參數(shù)并考察了基質(zhì)效應(yīng)，方法學(xué)考察及實際樣品測定證明該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，可用于香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量的檢測，具有一定的推廣價值。在香蕉生產(chǎn)過程中使用的農(nóng)藥，除新煙堿類殺蟲劑外還包括有機磷類、菊酯類殺蟲劑、殺菌劑和植物生長調(diào)節(jié)劑等，將該方法延伸至更多目標(biāo)物，能有效提高食品安全檢測效率，將會是未來研究的一個關(guān)注點。

參考文獻(xiàn)：

[1]Goulson D. Review：an overview of the environmental risks posed by neonicotinoid insecticides[J]. Journal of Applied Ecology，2013，50（4）：977-987.

[2]李?強，付步禮，邱海燕，等. 滴灌施藥技術(shù)防治香蕉黃胸薊馬應(yīng)用展望[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報，2018，8（4）：14-18.

[3]Poulsen M E，Andersen J H，Petersen A，et al. Results from the Danish monitoring programme for pesticide residues from the period 2004—2011[J]. Food Control，2017，74：25-33.

[4]Tosi S，Burgio G，Nieh J C. A common neonicotinoid pesticide，thiamethoxam，impairs honey bee flight ability[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：1201.

[5]袁?銳，李麗莉，李?超，等. 六種新煙堿類殺蟲劑對凹唇壁蜂的毒性及風(fēng)險評估[J]. 昆蟲學(xué)報，2018，61（8）：950-956.

[6]李田田，鄭珊珊，王?晶，等. 新煙堿類農(nóng)藥的污染現(xiàn)狀及轉(zhuǎn)化行為研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2018，13（4）：9-21.

[7]Anastassiades M，Lehotay S J，Stajnbaher D，et al. Fast and easy multi-residue method employing acetonitrile extraction/partitioning an“dispersive solid-phase extraction”for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAC International，2003，86（2）：412-431.

[8]Hou X，Lei S，Qiu S，et al. A multi-residue method for the determination of pesticides in tea using multi-walled carbon nanotubes as a dispersive solid phase extraction absorbent[J]. Food Chemistry，2014，153：121-129.

[9]Jakubus A，Tyma M，Stepnowski P，et al. Application of passive sampling devices based on multi-walled carbon nanotubes for the isolation of selected pharmaceuticals and phenolic compounds in water samples - possibilities and limitations[J]. Talanta，2017，164：700-707.

[10]HanZ，JiangK，F(xiàn)anZ，etal.Multi-walledcarbonnanotubes-

based magnetic solid-phase extraction for the determination of zearalenone and its derivatives in maize by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Control，2017，79：177-184.

[11]Lehotay S J. Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate：collaborative study[J]. Journal of AOAC International，2007，90（2）：485-520.

[12]Foods of plant origin-Determination of pesticide residues usingGC-MS and/or LC-MS/MS following acetonitrile extraction/partitioning and clean-up by dispersive SPE-QuEChERS-method：European Standard EN 15662[S]. Brussels：Europe and Committee for Standardization，2008.

[13]田海英，韋鳳杰，張東豫，等. RP-HPLC法測定煙草中的質(zhì)體色素[J]. 煙草科技，2009（4）：32-36.

[14]農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則：NY/T 788—2004[S]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[15]Kruve A，Künnapas A，Herodes K，et al. Matrix effects in pesticide multi-residue analysis by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2008，1187（1/2）：58-66.

[16]劉進(jìn)璽，秦珊珊，馮書惠，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用菌中農(nóng)藥多殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J]. 食品科學(xué)，2016，37（18）：171-177.

[17]Garrido F A，Martínez V J L，F(xiàn)ernández M J L，et al. Compensation for matrix effects in gas chromatography-tandem mass spectrometry using a single point standardaddition[J]. Journal of Chromatography A，2009，1216（23）：4798-4808.

[18]Martínez-Galera M，López-López T，Gil-García M D，et al. A comparative study of the correction of systematic errors in the quantitation of pyrethroids in vegetables using calibration curves prepared using standards in pure solvent[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2003，375（5）：653-660.

[19]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品中農(nóng)藥殘留最大限量：GB 2763—2016[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.