大別山山核桃果實與葉片性狀的表型多樣性研究

張深梅，奚建偉，洪俊彥，夏國華，李 巖，黃興召，朱先富，黃堅欽＊

(1. 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥 230036；4. 金寨縣富東生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，安徽 六安 237000)

植物表型是物種各種形態(tài)特征的組合，是基因與環(huán)境共同調(diào)控的結(jié)果[1]，表型變異是植物適應(yīng)不同環(huán)境條件的表現(xiàn)，因此，其在適應(yīng)環(huán)境與進化上具有重要意義[2]。遺傳多樣性是群體間和群體內(nèi)個體間遺傳變異的綜合[3]，表型多樣性主要研究群體在不同生境條件下的表型變異規(guī)律及分布格局，是遺傳多樣性的重要組成部分[4]。植物經(jīng)過長期的自然選擇與環(huán)境壓力，其生長發(fā)育水平往往會發(fā)生不可逆的變化，進而引起形態(tài)特征的變異產(chǎn)生新的表型[5]。通過表型性狀多樣性的研究可以了解植物對生態(tài)環(huán)境的響應(yīng)機制和遺傳變異規(guī)律[6-7]，尤其在物種種質(zhì)資源的收集、保存、評價與利用研究等方面極為重要，保持豐富的變異對于天然群體十分有利。

大別山山核桃（Carya dabieshanensis M. C. Liu et Z. J. Li）是胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya Nutt.）的多年生落葉喬木，是一種重要木本油料樹種，同時兼具較高的經(jīng)濟和生態(tài)價值[8-9]，主要分布于我國安徽、湖北、河南三省交界的大別山山區(qū)（29～31° N，115～116° E，海拔600～900 m）。大別山山核桃是劉茂春等[10]在進行植物調(diào)查時首次在金寨縣燕子河鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為大別山山核桃是另一個不同于山核桃（C. cathayensis Sarg.）的新種，Youjun, et al[11]也支持此觀點，并通過基因組測序得出大別山山核桃與山核桃的親緣關(guān)系最近。與山核桃相比，大別山山核桃具有籽大、殼薄、出仁率和出油率較高的優(yōu)點[12-15]，其果仁中所含的豐富的不飽和脂肪酸、維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分對于健腦、抗腫瘤和預(yù)防心腦血管疾病具有重要作用[16]，有很好的開發(fā)利用價值。

目前，對大別山山核桃的研究主要涉及到果實營養(yǎng)品質(zhì)、繁殖栽培方法、生產(chǎn)開發(fā)以及新品種選育等方面[17-20]，而大別山山核桃種群遺傳多樣性的調(diào)查是開展各項研究的基礎(chǔ)，近年來對其調(diào)查范圍及取樣數(shù)量也不斷增多。王正加等[21]選取3個天然群體利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對大別山山核桃的種群遺傳多樣性進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其種群內(nèi)有較豐富的變異；夏國華等[15]選取了9個種群對其表型及脂肪酸組分進行分析，認(rèn)為堅果表型性狀和脂肪酸組分遺傳變異豐富；龐賽[22]選取13個種群，對堅果經(jīng)濟性狀和營養(yǎng)物質(zhì)含量進行分析，認(rèn)為大別山山核桃具有較好的遺傳多態(tài)性，存在著豐富的變異?；谇叭藢Υ髣e山山核桃的研究，本文選取了19個天然種群的大別山山核桃，旨在更系統(tǒng)全面的揭示大別山山核桃表型性狀與地理分布的關(guān)系及其變異規(guī)律，為后續(xù)的種質(zhì)資源收集、優(yōu)選、改良提供理論支持，為大別山山核桃的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在大別山山核桃自然成熟期間，于2017年9月上中旬在其主要分布區(qū)進行取樣，各取樣點分別位于安徽省六安市金寨縣吳家店鎮(zhèn)、天堂寨鎮(zhèn)、斑竹園鎮(zhèn)、燕子河鎮(zhèn)、古碑鎮(zhèn)、關(guān)廟鄉(xiāng)、長嶺鄉(xiāng)、果子園鎮(zhèn)、沙河鄉(xiāng)和霍山縣太陽鄉(xiāng)及湖北省羅田縣九資河鎮(zhèn)，共選取198個單株。根據(jù)各種群的大小確定適量的采樣植株數(shù)，選取樹齡、長勢相近的健康植株，單株間距50 m以上，對其拍照并用全球衛(wèi)星系統(tǒng)定位各單株地理位置及海拔，各種群地理位置信息見表1，對應(yīng)的種群分布見圖1。

分別取果實和葉片兩部分樣品，每個單株取中下部樹冠外圍的果實1.5～3.0 kg，稱鮮質(zhì)量后放置于編織網(wǎng)中，保持通風(fēng)，以防發(fā)霉；在植株的4個方向均選取中下部枝條，取各枝條中部成熟的完整復(fù)葉共12片，帶回室內(nèi)進行表型性狀測定。

圖 1 大別山山核桃天然種群分布圖Fig. 1 Map of natural population distribution of C.dabieshanensis

1.2 測定方法

每單株隨機選取30個大小均勻無病害的果實進行表型測定，果實鮮質(zhì)量與堅果鮮質(zhì)量均采用10粒一組用電子天平稱總質(zhì)量求平均值的方法得出。果實縱徑、果實橫徑、堅果縱徑、堅果橫徑用游標(biāo)卡尺（精度0.01 mm）進行測量；蒲殼厚度即外果皮厚度，取山核桃中部兩棱之間的外果皮，測定其切面的厚度；敲碎堅果取堅果殼及隔膜，選擇其厚度均勻的部分測量果殼厚度、隔膜厚度。果形指數(shù)采用以下公式計算：果形指數(shù)=堅果縱徑/堅果橫徑。

葉片形態(tài)中頂生小葉葉長、寬，側(cè)生小葉葉長、寬，使用直尺測量（精度0.01 cm）。

頂生小葉葉形比=頂生小葉葉長/頂生小葉葉寬。側(cè)生小葉葉形比=側(cè)生小葉葉長/側(cè)生小葉葉寬。每個單株隨機選取3片大小相似的完整復(fù)葉，頂生小葉選取頂部葉片測定，側(cè)生小葉選取第一組右側(cè)的葉片測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用單因素方差分析，嵌套設(shè)計方差分析等計算各表型性狀在種群間和種群內(nèi)的變異規(guī)律及特征；應(yīng)用相關(guān)性分析揭示各表型性狀間的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)使用pearson系數(shù)。在方差分析的基礎(chǔ)上對各表型性狀進行多重比較，種群內(nèi)各表型性狀的變異程度為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，離散程度用變異系數(shù)（CV）表示。

CV =(標(biāo)準(zhǔn)差/平均值) ×100%

表型分化系數(shù) VST=δ2t/s/(δ2t/s+ δ2s)× 100%

式中：δ2t/s、δ2s分別為群體間、群體內(nèi)的方差。

以上數(shù)據(jù)分析在Spss22.0軟件上完成，方差分量的計算在Minitab 17.0軟件中完成，非加權(quán)配對算數(shù)平均法的聚類分析在R3.4.3軟件中完成，其他數(shù)據(jù)處理在Excel2016軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實與葉片性狀在種群間和種群內(nèi)的變異特征

大別山山核桃16個表型性狀的方差分析見表2。經(jīng)F值檢驗，果實與葉片性狀在種群間和種群內(nèi)差異極顯著（P＜0.01），說明大別山山核桃在種群間和種群內(nèi)變異豐富。各表型性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和多重比較結(jié)果（表3）表明：大部分種群間存在顯著差異，其中，沙棗（SZ）種群的果實鮮質(zhì)量、果實橫徑、堅果橫徑最大，外果皮、堅果殼最厚；吳包（WB）種群的果形指數(shù)最大（1.31），果實形態(tài)為橢圓形；古宋（GS）種群果形指數(shù)最?。?.07），果實形態(tài)為圓形，其堅果縱徑最小。吳蔡（WC）種群的堅果殼厚度與隔膜厚度均最小，沙吳（SW）種群的果實鮮質(zhì)量、果實橫徑最小，蒲殼也最薄。沙盧（SL）種群的堅果鮮質(zhì)量、堅果縱徑最大，其頂生小葉葉長、葉寬，側(cè)生小葉葉長、葉寬均最小，沙棗（SZ）種群頂、側(cè)生小葉葉形比最小，關(guān)周（GZ）種群頂、側(cè)生小葉葉形比最大。

2.2 大別山山核桃表型性狀的變異情況

19個大別山山核桃種群的表型性狀變異范圍為1.64%～26.59%，平均變異系數(shù)為9.63%（表4）。不同種群間同一表型性狀的變異范圍不同，同一種群內(nèi)的表型變異也因不同性狀而有差別。

在所有表型性狀中，以頂生小葉葉寬的平均變異系數(shù)最高（18.66%），其次是側(cè)生小葉葉寬（17.85%），果形指數(shù)的平均變異系數(shù)最?。?.98%）。16種表型性狀的變異情況不同，但總體上葉片表型的變異程度高于果實表型。對于不同的種群，平均變異系數(shù)最大的是YL種群（11.59%），其次為GX種群（11.42%），而TY種群的平均變異系數(shù)最?。?.68%），這表明YL、GX種群的表型變異更豐富。綜合比較果實表型與葉片表型在種群內(nèi)和種群間的平均變異系數(shù)，種群內(nèi)的平均變異系數(shù)均小于種群間。分開來看，果實性狀在種群內(nèi)的變異系數(shù)（6.16%）小于葉片性狀的變異系數(shù)（15.42%），在種群間的變異系數(shù)（12.95%）也小于葉片表型的變異系數(shù)（16.62%）。表明大別山山核桃的葉片性狀較果實性狀其變異程度更大，果實與葉片性狀在種群間的變異均大于種群內(nèi)。

表 2 大別山山核桃種群間和種群內(nèi)的表型性狀方差分析Table 2 Analysis of variance of phenotypic traits among and within populations in C. dabieshanensis

2.3 大別山山核桃果實及葉片性狀間的相關(guān)性

果實與葉片性狀的相關(guān)性分析（表5）表明：性狀間達極顯著相關(guān)的有60對，達顯著相關(guān)的有11對。在果實表型性狀中，果實鮮質(zhì)量，果實縱徑，果實橫徑這3個性狀與其他果實表型性狀基本上都存在極顯著正相關(guān)，其中，果實橫徑與果實鮮質(zhì)量、蒲殼厚度，果形指數(shù)與果實縱徑、堅果縱徑這6組性狀的相關(guān)性極高，pearson相關(guān)系數(shù)均在0.75以上。這表明，果實橫徑的增加會引起果實鮮質(zhì)量和蒲殼厚度的增加；而果實縱徑與堅果縱徑的變化也與果形指數(shù)的大小緊密相關(guān)。對于葉片的表型性狀，所有葉片性狀相互間均存在顯著或極顯著相關(guān)，其中，頂生小葉葉長與頂生小葉葉寬、側(cè)生小葉葉長，頂生小葉葉寬與側(cè)生小葉葉長、側(cè)生小葉葉寬，側(cè)生小葉葉長與側(cè)生小葉葉寬這5組性狀的相關(guān)性極高，pearson相關(guān)系數(shù)系數(shù)均大于0.7。在果實表型與葉片表型相關(guān)的區(qū)域，果實鮮質(zhì)量、果實橫徑、蒲殼厚度均與頂生小葉葉長、葉寬，側(cè)生小葉葉長這3個性狀存在極顯著正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)較低。

2.4 大別山山核桃種群間的表型分化

大別山山核桃果實與葉片性狀的表型分化系數(shù)和方差分量（表6）表明：表型分化系數(shù)為25.23%～89.43%，平均為66.25%，即種群內(nèi)的表型分化系數(shù)為33.75%。這表明種群間的遺傳分化遠(yuǎn)大于種群內(nèi)，大別山山核桃表型變異的主要來源為種群間。比較果實性狀與葉片性狀的平均表型分化系數(shù)，果實性狀（VST=78.26%）＞葉片（VST=46.25%），即果實性狀在種群間的分化大于葉片，葉片性狀的變異主要來源于種群內(nèi)。除堅果橫徑外，果實性狀中的其他性狀表型分化系數(shù)均大于70%，這表明果實性狀以群體間的變異為主要變異。

表 3 大別山山核桃果實表型性狀平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差及多重比較Table 3 Average value, standard deviation and multiple comparison of phenotypic characters of pecan fruit in C.dabieshanensis

表 4 大別山山核桃天然種群果實、葉片表型性狀平均變異系數(shù)Table 4 Average coefficient of variation of phenotypic characters in natural populations of pecan in C. dabieshanensis

表 5 大別山山核桃果實與葉片性狀的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of fruit and leaf characters of pecan in C. dabieshanensis

表 6 大別山山核桃表型性狀的方差分量及種群間表型分化系數(shù)Table 6 Variance components of phenotypic traits and differentiation coefficient among populations in C. dabieshanensis

2.5 大別山山核桃種群聚類分析

基于前期對于葉片表型的分析，由于其變異系數(shù)大，性狀不穩(wěn)定易受環(huán)境影響，而頂生小葉葉形比、側(cè)生小葉葉形比這2個性狀相對于其他葉片性狀變異較小，因此，在進行UPGMA聚類分析時，只應(yīng)用了以上2個葉片性狀及所有果實表型進行計算。結(jié)果（圖2）表明：在距離系數(shù)為0.06時，19個種群可聚為2類，其中，SZ、BQ種群單獨聚為一類，其余種群聚為一類?？赡苡捎贐Q、SZ 2個種群的經(jīng)度同為 115°28′ E，海拔高差300多米，距離較近有利于花粉傳播，從而產(chǎn)生基因交流使其單獨聚為一類。當(dāng)距離系數(shù)為0.04時，可聚為4類，SZ、BQ種群為第Ⅰ類；GZ、JX、WB、GY、WZ、WC這6個種群為第Ⅱ類，除GZ種群外，其余5個種群經(jīng)度均為115°35′～115°39′ E，且緯度也較接近；GX、SL、GN、SW 4個種群聚為第Ⅲ類，僅GN種群經(jīng)度為115°22′E，其余 3 個種群經(jīng)度均為 115°23′ E；GT、GS、TY、YL、CZ、YW、TB 7個種群聚為第Ⅳ類，它們的經(jīng)度為 115°46′～116°10′ E，屬于 19 個種群中的高經(jīng)度種群。對應(yīng)實際的地理位置分布，UPGMA聚類基本與經(jīng)度的變化一致，這可能與局部降水條件有關(guān)，但部分地理位置較近的種群并沒有聚在一起。

圖 2 不同地理種群的大別山山核桃表型性狀的UPGMA聚類圖Fig. 2 UPGMA cluster map of phenotypic traits in C.dabieshanensis with different geographical populations

3 討論

3.1 大別山山核桃不同種群的表型變異來源

通過對19個天然種群的果實與葉片表型性狀的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大別山山核桃在種群間和種群內(nèi)均存在極顯著差異，表明大別山山核桃天然種群具有豐富的表型變異，此結(jié)果與郭傳友[23]，龐賽[22]對大別山山核桃天然群體的調(diào)查結(jié)果一致。其他物種如思茅松[24]，青梅[25]，香椿[3]，云南松[26]，油松[27]等在種群間和種群內(nèi)也表現(xiàn)為極顯著差異，具有很好的育種潛力，可為后期的遺傳品質(zhì)改良工作奠定重要基礎(chǔ)。

表型分化系數(shù)表明了物種對于環(huán)境的適應(yīng)情況，其值的大小與物種能夠適應(yīng)的范圍成正比[24]。大別山山核桃16個表型性狀的平均分化系數(shù)VST=66.25%，高于岷江柏VST=43.4%[28]、長柄扁桃VST=45.90%[29]、白花樹VST=59.08%[30]等物種，與山蒼子 VST=60.19%[31]、無患子 VST=62.21%[32]、內(nèi)蒙古山杏VST=73.03%[33]接近，而遠(yuǎn)低于滇西北野生牡丹VST=98.51%[34]，表明大別山山核桃天然種群分化程度較高，對環(huán)境的適應(yīng)能力較強，種群間變異是表型變異的主要來源。

從地理位置的分布看，大別山山核桃天然種群的分布范圍較狹窄，經(jīng)緯度之差1度，而海拔落差約500 m，各種群分布于不同的山脈，產(chǎn)生諸多不同的局部小氣候，且花粉傳播也受到山脈的阻隔，這可能是引起種群間差異的原因之一。從繁殖系統(tǒng)看，大別山山核桃是雌雄同株異花植物，風(fēng)媒異花傳粉[35]，但花期經(jīng)常會遭受連綿陰雨，影響花粉傳播，減少種群間的交流。另外，山核桃果實無休眠期，在溫度濕度合適的情況下即可萌發(fā)，甚至在雨水較多的年份會出現(xiàn)果實未完全成熟卻已出芽萌發(fā)的狀況，使得種群內(nèi)部幼苗增多，種子傳播距離也縮短，種群間交流減少，逐步形成分化[36]。

3.2 大別山山核桃果實與葉片表型的變異規(guī)律

種群間的變異反映了地理與生殖隔離上的變異，植物在種群間保持較大的變異也有在進化上的積極意義[34]。大別山山核桃果實與葉片性狀在種群間變異均大于種群內(nèi)變異，即果實與葉片性狀均以種群間變異為主。相比于葉片表型，果實表型性狀相對穩(wěn)定，而葉片性狀具有更豐富的表型多樣性，此結(jié)果與山蒼子[31]、浙江楠[37]的調(diào)查結(jié)果一致。這可能與葉片的功能有關(guān)，葉片屬于營養(yǎng)器官，通過光合作用為植物提供養(yǎng)分，易受到環(huán)境因素的影響，變異性較強；而果實屬于生殖器官，主要受自身遺傳因素控制，性狀相對穩(wěn)定，這也保證了物種遺傳上的相似性和穩(wěn)定性[38]。

果實性狀的變異程度因性狀不同而差異較大，大別山山核桃果實鮮質(zhì)量、堅果鮮質(zhì)量與蒲殼厚度在所有果實表型中均呈現(xiàn)較大的變異，而果實橫、縱徑和堅果橫、縱徑的變異程度較小，這與翟大才等[39]對皖南山核桃表型性狀的調(diào)查結(jié)果一致。兩地果實性狀的變異系數(shù)相比，除蒲殼厚度和堅果鮮質(zhì)量2個性狀以外，皖南山核桃其他果實性狀的變異系數(shù)均大于大別山山核桃的；與安徽地區(qū)華東野核桃[40]和不同無性系的美國山核桃[41]對應(yīng)的果實性狀相比，大別山山核桃的果實表型變異系數(shù)均小于華東野核桃和美國山核桃，即大別山山核桃的果實性狀變異程度更低，更不易受環(huán)境的影響，在遺傳上表現(xiàn)也較穩(wěn)定，對植物分類有重要作用[38]。種群變異系數(shù)可以反映種群的多樣性豐富度，大別山山核桃19個種群的變異程度相似，平均值為9.63%，其中，YL、GX、SL、SW 4個種群的平均變異系數(shù)均大于10%，表型多樣性較豐富，由于YL種群分布范圍較小，其他3個種群的部分性狀表現(xiàn)優(yōu)良，因此，在進行種質(zhì)資源選育與利用時，可重點考慮GX、SL、SW種群。

3.3 大別山山核桃的重要性狀及經(jīng)濟效益

大別山山核桃作為優(yōu)良的油料作物，富含優(yōu)質(zhì)脂肪酸及人體必需氨基酸，營養(yǎng)價值高，近年來逐步得到市場認(rèn)可，經(jīng)濟價值也逐步提高。蒲殼厚度、堅果殼厚度及隔膜厚度這些性狀是評定果實經(jīng)濟價值的重要指標(biāo)，蒲殼厚度越小，出籽率越高；堅果殼厚度和隔膜厚度越小，則出仁率越高，經(jīng)濟效益更好。皖南山核桃果實表型與營養(yǎng)成分的相關(guān)性分析表明，堅果殼厚度與蛋白質(zhì)、脂肪、油酸和亞油酸的含量呈顯著正相關(guān)，因此，堅果殼較厚的山核桃可能營養(yǎng)價值更高[39]。蒲殼厚度與果實鮮質(zhì)量、果實縱徑、果實橫徑呈極顯著正相關(guān)，這表明果實越大，其質(zhì)量越大，則蒲殼越厚，而且扁圓形果實的蒲殼會更厚。堅果殼厚度與堅果橫徑、隔膜厚度呈極顯著正相關(guān)，與果實縱徑、堅果縱徑、果形指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，即堅果橫徑越大，堅果殼越厚，而堅果縱徑越大，果形細(xì)長的果實其堅果殼越薄，這在優(yōu)良種質(zhì)資源選育中有重要意義。

從經(jīng)濟效益的角度看，WB、WC 2個種群的堅果縱徑、果形指數(shù)都較大，堅果殼、隔膜厚度也較薄，堅果呈橢圓形，可在這2個種群中選擇薄殼橢圓形大果的大別山山核桃；GX、SL種群堅果鮮質(zhì)量較大，而蒲殼較薄，可在其中選擇籽大殼薄、出籽率高的優(yōu)良種質(zhì)；SW種群蒲殼最薄，果實鮮質(zhì)量、果實橫徑在所有種群中最小，堅果殼、隔膜也較薄，可選擇小果薄殼出仁率高的大別山山核桃。

4 結(jié) 論

大別山山核桃天然種群的果實與葉片性狀在種群間和種群內(nèi)均存在極顯著差異，其表型多樣性非常豐富，變異主要來自于種群間。果實表型相對于葉片表型其性狀更加穩(wěn)定，其中果形指數(shù)的變異程度最小，性狀最穩(wěn)定。WB、WC、GX、SL、SW種群在經(jīng)濟價值方面表現(xiàn)良好，GX、SL、SW 3個種群表型多樣性豐富且性狀優(yōu)良，可重點關(guān)注。在進行種質(zhì)資源選育時，可從種群間和種群內(nèi)兩個層次展開，在增加取樣種群密度的同時也應(yīng)增大每個種群的取樣范圍，以選擇出最優(yōu)、最適的種質(zhì)。大別山山核桃天然種群因生態(tài)環(huán)境、遺傳因子、栽培管理情況的不同，產(chǎn)生了豐富的表型變異，本文對大別山山核桃的表型變異特征、來源及規(guī)律進行分析，為大別山山核桃種質(zhì)資源的改良及新品種選育奠定了理論基礎(chǔ)，對于其種質(zhì)資源的保護、評價和利用有重要意義。