不同炒制工藝對紫蘇子化學成分的影響*

★ 羅宇琴 楊文惠 潘禮業(yè) 魏梅 陳向東 馬瑞瑞 吳文平 霍文杰 李國衛(wèi)* 孫冬梅（廣東一方制藥有限公司 廣東 佛山 528244）

紫蘇子為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens（L.）Britt. 的干燥成熟果實，秋季果實成熟時采收，除去雜質，曬干，紫蘇資源在我國分布范圍較廣，分布于廣東、廣西、湖北、云南、貴州、四川、臺灣、浙江、安徽、福建等省區(qū)［1］，紫蘇屬植物喜溫、短日照，適應能力強，目前在我國的東北、西北、東南及西南地區(qū)21個省均有種植。其性溫，味辛，具有降氣化痰，止咳平喘，潤腸通便的功能，臨床主要用于治療痰壅氣逆，咳嗽氣喘，腸燥便秘等［2］。

目前對紫蘇子的炒制工藝多為清炒，如《中國藥典》2015年版［2］紫蘇子飲片項下為“取凈紫蘇子，照清炒法，炒至有爆聲”，《天津市中藥飲片炮制規(guī)范》［3］為“將鍋加熱，取凈蘇子置鍋內，炒至表面顔色加深，嗅有香氣逸出時，取出，放涼”?！逗鲜≈兴庯嬈谥埔?guī)范》［4］為“取凈蘇子，用文火炒至有爆聲，取出，放涼”?！渡虾Ｊ兄兴庯嬈谥埔?guī)范》［5］為“取生紫蘇子，照清炒法，炒至有爆聲”，但上述炒制方法均為經驗性的術語難以進行量化控制，均未對炒制過程進行規(guī)范化說明。同時，紫蘇子生品善于潤燥滑腸，而炒后善于溫肺降氣的藥效作用增強，未能說明紫蘇子炒制過程中到底是哪些化學成分發(fā)生了變化，是否產生了新的化學成分，這些產生的化學變化與炒制后辛散之性緩和及溫肺降氣作用增強之間有何聯系［6］。因此需要進一步針對種子類中藥炒制過程成分變化規(guī)律進行分析和研究［7］。本研究擬通過正交試驗，優(yōu)選紫蘇子飲片炒制工藝參數，同時說明不同炒制工藝對紫蘇子化學成分的影響，為炒制過程的規(guī)范化及炒紫蘇子的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 實驗儀器 Waters高效液相色譜儀（Waters e2695），Waters超高效液相色譜儀（H-Class），Agilent SB C18色 譜 柱（4.6mm×150mm，5μm），Agilent SB C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；萬分之一天平（梅特勒-托利多公司，ME204E）；百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司，XP26）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司，HWS-28）；數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；電陶爐（江蘇九陽，H22-X3）；超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司，Milli-Q Direct）。

1.2 實驗材料 咖啡酸（批號：110885-201703，純度：99.7%）、迷迭香酸（批號：110871-201706，純度：90.5%）、木犀草素（批號：111520-201605，純度：99.6%）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，其他試劑為分析純。本實驗所用的紫蘇子藥材由廣東一方制藥有限公司提供，采自甘肅省慶陽寧縣春榮鎮(zhèn)，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為Perillafrutescens（L.）Britt.的干燥成熟果實，樣品保存于質量中心。

2 方法

2.1 紫蘇子的炒制方法優(yōu)化 本試驗在傳統(tǒng)炒制工藝基礎上，取凈選后的紫蘇子100g，平行9份，采用正交設計來對電炒鍋功率（A）、炒制時間（B）、翻動頻率（C）進行優(yōu)選，每個因素取3個水平，見表1。分別以迷迭香酸含量及基于主成分分析的4個特征峰峰面積/稱樣量標準化值為指標，進行炒制工藝評價。

表1 紫蘇子炒制工藝參數設計

2.2 迷迭香酸含量測定方法 參照中國藥典2015年版紫蘇子項下含量測定方法。

2.3 紫蘇子特征圖譜方法

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長100mm，內徑2.1mm，粒徑1.8μm）；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，按梯度洗脫（0～6min，10% → 18%A；6～15min，18% → 50%A）；流速為0.3mL/min；檢測波長為330nm；柱溫為30℃；進樣量為2μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素對照品適量，加甲醇配制成每mL各含咖啡酸3μg、迷迭香酸 40μg、木犀草素 5μg的混合對照品溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取紫蘇子飲片（過二號篩）適量，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，用80%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 取紫蘇子飲片（過二號篩）適量，取約0.5g，精密稱定，按照“2.3.3”項下制備供試品溶液，分別取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液，各進樣2μL，結果見圖1。

圖1 紫蘇子特征圖譜專屬性考察

通過專屬性實驗結果表明，該分析方法能正確檢測所指認的特征峰，不受提取溶劑的干擾。

2.4.2 精密度考察 取紫蘇子藥材按照“2.3.3”項下制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件重復進樣6次，進樣體積2μL。以迷迭香酸峰為參照峰，計算其他特征峰相對保留時間及相對峰面積RSD值，結果各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD＜1%，該儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取紫蘇子藥材按照“2.3.3”項下制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件，分別在0，1，2，4，8，12小時進樣，進樣體積2μL。以迷迭香酸峰為參照峰，計算其他特征峰相對保留時間及相對峰面積RSD值，結果12小時內各色譜峰相對保留時間的RSD＜1%，相對峰面積的RSD＜5%，說明該供試品溶液在12小時內基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復性考察 取同一批紫蘇子約0.5g，精密稱定，平行6份，按按照“2.3.3”項下制備供試品溶液，按“2.3.1”項下規(guī)定的色譜條件，分別進樣2μL。以迷迭香酸峰為參照峰，計算其他特征峰相對保留時間及相對峰面積RSD值，結果各色譜峰相對保留時間＜1%，相對峰面積的RSD＜5%，說明該方法重復性較好。

2.5 樣品測定 基于已建立的特征圖譜方法對紫蘇子不同炒制品進行測定，以迷迭香酸峰為參照峰，分別計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積。

3 結果與分析

3.1 迷迭香酸含量測定結果 參照中國藥典2015年版紫蘇子項下含量測定方法，對不同炒制工藝紫蘇子水分及迷迭香酸含量測定結果見表2。結果表明，在該炒制工藝下，紫蘇子炒制品均符合中國藥典2015版炒紫蘇子項下含量限度（以迷迭香酸計，不得低于0.20%）。但以迷迭香酸作為單指標評價紫蘇子炒制工藝缺乏一定合理性。

表2 不同炒制工藝迷迭香酸含量測定結果 %

3.2 特征圖譜測定結果 特征圖譜測定結果表明，以迷迭香酸為S峰，分別計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值，結果見表3～4，同一批次紫蘇子飲片不同試驗號樣品特征圖譜的相對保留時間RSD值在0.02%～0.74%，偏差較小，相對峰面積RSD值在4.68%～128.07%，波動較大，說明不同炒制工藝間樣品特征圖譜差異較大。9批樣品疊加圖見圖2。

表3 紫蘇子不同炒制品特征圖譜結果（相對保留時間）

表4 紫蘇子不同炒制品特征圖譜結果（相對峰面積）

圖2 炒紫蘇子特征圖譜疊加圖

3.3 紫蘇子炒制工藝參數優(yōu)化

3.3.1 主成分分析 不同炒制工藝中經特征圖譜結果發(fā)現明顯產生特征峰X1、X2，說明經炒制后有明顯成分變化，為進一步說明炒制參數的合理性以適應工業(yè)化生產，因此需進一步對炒制工藝參數進行優(yōu)化。本研究以特征峰峰面積/稱樣量為指標對不同炒制品進行研究，結果見表5。

應用SPSS20.0軟件對紫蘇子不同炒制品的特征峰峰面積進行主成分分析，選擇特征值＞1的指標為主成分，結果提取出兩個主成分，累積貢獻率達到94.56%。結果見表6。因此選擇提取的兩個主成分進行分析，從旋轉成分矩陣來看，第一主成分主要反映了來自原始色譜峰1、2（咖啡酸）、3、4、5、6（迷迭香酸）的信息，第二主成分主要反映了來自原始色譜峰X1、X2、7的信息，因此根據各特征峰對主成分的影響系數，其中峰5、峰6（迷迭香酸）對主成分1影響較大，峰7（木犀草素）、X1、X2對主成分2影響較大，結果見表7。

表5 炒紫蘇子特征圖譜峰面積/稱樣量值

表6 解釋的總方差

表7 旋轉成份矩陣a

3.3.2 方差分析 基于主成分分析結果，選已知峰迷迭香酸及木犀草素為指標考察紫蘇子的炒制工藝，以迷迭香酸及木犀草素特征峰峰面積/稱樣量，按公式Xij’=Xij/Xijmax進行標準化處理，Xij’為樣品中第i類成分j的標準化值，Xij為樣品中第i類成分j的值，Xijmax為樣品中第i類成分j的最大值。經文獻研究，紫蘇子經炒制后，黃酮類成分含量較生品增加，而迷迭香酸因受熱易分解，因此按照炒制工藝選擇中的主次地位，賦予不同的加權系數，以標準化后的值Xij’加權后求和，及綜合評價指標Y=迷迭香酸×12%+木犀草素×88%），結果見表8。進一步將Y值代入正交試驗表，正交試驗結果見表9，得到方差分析結果見表10。

直觀分析結果表明，三因素對結果影響的大小順序為：電炒鍋功率＞翻動頻率＞炒制時間。方差分析結果表明，影響因素A的水平變化對于炒制工藝實驗結果有顯著影響，考慮到因素B（炒制時間）在水平1和水平3差異不大，因此綜合得到最佳炒制工藝為A3B1C2，即控制鍋溫為190℃，電炒鍋功率為1000W，炒制時間4min，翻炒頻率為60次/min。

表8 炒紫蘇子標準化指標處理結果

表9 炒紫蘇子正交試驗結果表

表10 炒紫蘇子方差分析表

3.4 紫蘇子炒制工藝驗證 另平行稱取三批紫蘇子，按照上述炒制工藝，進行炒制，得到三批樣品工藝驗證，含量測定結果見表11，特征圖譜相對保留時間及相對峰面積結果見表12～13。結果表明，三批樣品工藝驗證迷迭香酸含量測定均值為0.33%，RSD值為1.11%，說明，三批樣品含量無明顯差異，三批樣品相對保留時間RSD值在0.00%～1.30%，說明各特征峰相對保留時間偏差較小，但相對峰面積RSD值波動較大，可能與峰面積較小有關。整體來看，三批樣品炒制工藝的重現性較好。

表11 炒紫蘇子工藝驗證含量測定結果 %

表12 炒紫蘇子工藝驗證特征圖譜結果（相對保留時間）

表13 炒紫蘇子工藝驗證特征圖譜結果（相對峰面積）

4 討論

（1）考察影響紫蘇子特征圖譜的前處理方式，分別以甲醇、乙醇、80%甲醇、50%甲醇、稀乙醇作為提取溶劑時，其中50%甲醇及稀乙醇對木犀草素提取效率不高，整體以80%甲醇提取效率較高；分別考察超聲提取及加熱回流，發(fā)現兩者的提取效率相當，為操作的簡便性，選超聲提取方式；分別對超聲時間進行分析，超聲15、30、45min時，對色譜峰的提取效率相當，為保證提取充分，選擇超聲時間為30min。

（2）紫蘇子經炒制后迷迭香酸含量明顯降低，結合特征圖譜數據來看，從試驗號1～試驗號9，峰1、峰2（咖啡酸）、峰3的相對峰面積均呈現明顯下降趨勢，峰4、峰5的相對峰面積變化較為平緩，而峰X1、X2的相對峰面積呈現明顯梯度性上升趨勢，推測，兩者的峰面積變化與溫度有關，存在一個溫度拐點。同時，本實驗通過紅外測溫槍對炒制過程中的溫度進行測定，從試驗號1～9物料的出鍋溫度來看，其中試驗號1的出鍋溫度為110℃，試驗號2～3的出鍋溫度為125℃～130℃，試驗號4～5的出鍋溫度為140℃～145℃，試驗號6的出鍋溫度為157.2℃，試驗號7的出鍋溫度為170℃，試驗號6的出鍋溫度為185℃，試驗號6的出鍋溫度為200℃，因此推測，該溫度拐點可能在165℃～170℃。同時結合特征峰X1的紫外最大吸收分別在248nm與340nm，特征峰X2的最大吸收分別在243nm與344nm，位于黃酮類成分的紫外吸收區(qū)，推測可能為黃酮類成分，這可能是由于在炒制過程中該物質化學鍵發(fā)生改變，導致原來沒有紫外吸收度物質具有較強的紫外吸收。

（3）基于主成分分析，結合特征圖譜方法對紫蘇子炒制工藝進行研究，發(fā)現，當物料溫度為165℃～170℃時，咖啡酸、迷迭香酸等酚酸類成分明顯降低，而木犀草素等黃酮類成分增加，與文獻報道一致。根據“逢子必炒”的基本原則，經炒制后，紫蘇子揮發(fā)油含量降低，咖啡酸、迷迭香酸等酚酸類成分明顯降低，而木犀草素等黃酮類成分增加，與炒紫蘇子燥性減弱而溫肺降氣作用增強結論一致。但具體成分變化機制有待進一步研究。