石榴花揮發(fā)油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶對石榴花的增香作用研究

劉錚錚,劉語,宋寧,楊廣德

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

石榴花為石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的花，含有多酚類、黃酮類、萜類等活性成分[1]。石榴花性平、澀，可用于治療中耳炎、鼻衄、創(chuàng)傷出血、口臭、腋臭等；在維吾爾族醫(yī)學(xué)中素以“古麗娜”之稱而入藥，用于退翳，治神經(jīng)衰弱和惡心[2]；石榴花具有降糖作用，國內(nèi)外常用石榴花治療糖尿病及其并發(fā)癥[3-5]；石榴花提取物還具有抗氧化作用，能清除多種自由基和保護(hù)脂蛋白[6]。

早在1993年Angelika等[7]發(fā)現(xiàn)鞣花酸能明顯抑制化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌變及其他多種癌變，尤其對結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤等抑制作用更明顯。Wang等[8]從石榴花乙醇提取物中分離到一種新多酚類物質(zhì)，命名為石榴酸，該物質(zhì)有抗炎和抗氧化等藥理作用，自然界中分布較廣。

王超萍[9]利用紫外分光光度法測定石榴花中總黃酮類的含量。楊彥霞等[10]從石榴花中分離出12黃酮類個化合物。郭俊明等[11]對云南石榴花色素進(jìn)行研究，結(jié)果表明石榴花的色素為黃酮類成分。Zhang等[12]在石榴花中鑒定出了2種花青苷成分。

石榴花中含有少量的揮發(fā)油成分，陳志偉等[13]提取了石榴花中的揮發(fā)油，鑒定出石榴花中的揮發(fā)油成分，發(fā)現(xiàn)其主要成分為醛類和脂肪酸，還含有月桂烯、紅沒藥烯、法呢醇3種萜類化合物和二十一烷、二十四烷、二十五烷等5種烷烴類化合物。石榴花揮發(fā)油的體外抗氧化活性很好，可用于開發(fā)抗氧化保健品、藥品和天然保健抗氧化劑。

糖苷鍵合態(tài)香氣前體物質(zhì)(glycosidically boundaroma precursors)是以糖苷的形式存在于植物中的香氣前體物質(zhì)，不具有揮發(fā)性，穩(wěn)定性強(qiáng)；在酸或酶的作用下可以釋放出游離態(tài)芳香物質(zhì)[14]。β-葡萄糖苷酶又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，它屬于纖維素酶類。是一種廣泛存在于生物界的能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。植物中以苷形式存在的非揮發(fā)性前體物質(zhì)可以通過酶解作用使得香氣成分得以釋放表現(xiàn)出顯著的增香作用[15-16]。不僅如此，β-葡萄糖苷酶還能將果蔬及茶葉中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS分析石榴花揮發(fā)油化學(xué)成分，同時(shí)利用β-葡萄糖苷酶水解石榴花，以驗(yàn)證β-葡萄糖苷酶對其是否具有增香作用，為石榴花資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：石榴花采于2018年7月采自西安交通大學(xué)藥學(xué)院的藥園，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的花。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜純)；無水硫酸鈉(西安化學(xué)試劑廠，分析純)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠)；檸檬酸(成都化學(xué)試劑廠)。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；AY120電子天平(日本島津公司)；揮發(fā)油提取器(無錫久平儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應(yīng)。分別稱取2份200 g新鮮石榴花于500 mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中1份加0.2 g β-葡萄糖苷酶，同時(shí)置于搖床中50 °C恒溫水浴5 h。同法制備空白溶液。

1.2.2 揮發(fā)油的提取。將200 g β-葡萄糖苷酶水解前后的石榴花分別置于2000 mL圓底燒瓶中，加水800 mL，沸石數(shù)粒，搖勻，按2015年版《中國藥典》四部通則2204(揮發(fā)油測定法，甲法)提取揮發(fā)油，保持微沸4 h。讀取揮發(fā)油體積并收集所得揮發(fā)油，加入少量無水硫酸鈉，靜置。然后，稱取石榴花揮發(fā)油0.1 g置于5 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，待測。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的色譜條件。色譜條件：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：He(≥99.99 %)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：5∶1；升溫程序：色譜柱始60 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升溫至150 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持1 min；質(zhì)譜：接口溫度為250 ℃，離子源溫度：230 ℃，電子轟擊源EI，電子能量：70 eV，質(zhì)量掃描范圍：45～550 m/z；進(jìn)樣量：1 μL；溶劑峰切除時(shí)間為2.5 min，質(zhì)譜檢測起始時(shí)間為3 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與其內(nèi)存譜庫(NIST)自動檢索和解析，并用峰面積歸一法測定了各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對百分含量。

2 結(jié)果

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對β-葡萄糖苷酶處理前后的石榴花的揮發(fā)油提取物進(jìn)行分析，鑒定出無酶石榴花和有酶石榴花揮發(fā)油各42種化合物。其總離子流圖結(jié)果如下：

圖1 無酶石榴花揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

圖1 有酶石榴花揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

通過分析比較，確定色譜條件篩選后的GC-MS方法對色譜峰可以達(dá)到較好的分離。通過計(jì)算機(jī)譜庫檢索及核對質(zhì)譜圖，β-葡萄糖苷酶水解前后的石榴花揮發(fā)油提取物的化學(xué)成分分析見表1。

表1 石榴花揮發(fā)油化學(xué)成分分析表

續(xù)表1

保留時(shí)間/min化合物中文名稱分子式相對峰面積(%)無酶石榴花有酶石榴花31.539丁香酚C10H12O29.913.1234.230順式-茉莉酮C11H16O4.073.4136.074β-石竹烯C15H242.031.4837.241反式-α-香柑油烯C15H241.140.7538.684β-金合歡烯C15H240.500.2139.3402,6,10-三甲基十三烷C16H342.112.6341.743α-金合歡烯C15H247.837.9842.656β-倍半水芹烯C15H240.490.4546.962正十六烷C16H341.6514.9152.130正十七烷C17H362.527.1154.966菲C14H101.2810.0056.548正二十一烷C21H442.8715.56

β-葡萄糖苷酶處理前后石榴花揮發(fā)油成分分析：本次實(shí)驗(yàn)從無酶石榴花的揮發(fā)油提取物中確證了42個化合物，從有酶石榴花的揮發(fā)油提取物中確證了42個化合物，觀察到加入β-葡萄糖苷酶前后的石榴花揮發(fā)油的成分并無變化。

由表1可知，在無酶石榴花揮發(fā)油中的含有許多醛酮類、烯烴類和醇類物質(zhì)，其主要成分為苯乙醛(12.63%)、水楊酸甲酯(10.19%)、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(10.46%)、丁香酚(9.91%)、α-金合歡烯(7.83%)、糠醛(5.93%)等。在有酶石榴花揮發(fā)油中也含有醛酮類、烯烴類和醇類物質(zhì)，其主要成分為正二十一烷(15.56 %)、正十六烷(14.91%)、菲(10.00%)、α-金合歡烯(7.98 %)、水楊酸甲酯(7.22 %)、正十七烷(7.11 %)等。

通過表1的對比，可知在石榴花中β-葡萄糖苷酶存在作用。對比可知在加入β-葡萄糖苷酶后L-檸檬烯、2,6,10-三甲基十三烷、α-金合歡烯、正十六烷、正十七烷、菲、正二十一烷的相對含量分別增加0.15%、0.52%、0.15%、13.26%、4.59%、8.72%、12.69%，增長率達(dá)到55.56%、24.64%、1.92%、803.63%、182.14%、681.25%、442.16%。同時(shí)可以觀察到糠醛、苯乙醛、水楊酸甲酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、丁香酚等其余物質(zhì)的相對含量均出現(xiàn)明顯降低。

近年來，在風(fēng)味科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)很重視研究風(fēng)味物質(zhì)的前二級代謝產(chǎn)物，如糖苷類物質(zhì)。這些物質(zhì)本身無香味，不揮發(fā)，但若用酶水解，即可產(chǎn)生濃郁的具有天然特征風(fēng)味的物質(zhì)[19]。天然芳香植物中糖苷化合物的研究，一直是香料化學(xué)家們感興趣的研究課題之一，并將這類物質(zhì)納入“香味前驅(qū)體”(flavor precursors)[20]。一些植物由于含有很多的香精類因而表現(xiàn)出香味，不同的香精成分能夠表現(xiàn)出不同的氣味。石榴花中的許多成分可以用作香料，比如糠醛是GB 2760-96允許使用的食品用香料也是萃取溶劑，主要用于配制各種熱加工型香精，如面包、奶油硬糖、咖啡等香精；L-檸檬烯為無色液體，有似鮮花的清淡香氣，溶于乙醇和大多數(shù)非揮發(fā)性油，不溶于水，天然品存在于椒樣薄荷油、留蘭香油、松針油、桉葉油等中。苯乙醛主要用于風(fēng)信子、水仙、黃水仙、甜豆花等配方中，少量用于其他花香型中，賦予青的頭香，有提調(diào)香氣的作用；癸醛用于有機(jī)合成和作香料用，常用作鳶尾、橙花、素馨、香葉、香堇、玫瑰等香精的調(diào)配原料，在制造人工香檸檬油、橙花油、玫瑰油時(shí)也少量使用。香葉醇GB2760-96規(guī)定為允許使用的食用香料，主要用以配制蘋果、桃、杏、李、草莓、檸檬、姜、肉桂、肉豆蔻和蜂蜜等香精。

加入β-葡萄糖苷酶后石榴花的香精類成分含量除L-檸檬烯皆有所下降，非香精類成分2,6,10-三甲基十三烷、正十六烷、正十七烷、菲、正二十一烷的含量有所上升，表明β-葡萄糖苷酶對石榴花的增香作用不明顯。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)測定得到石榴花揮發(fā)油中42種化合物，測定了β-葡萄糖苷酶水解前后石榴花揮發(fā)油的化學(xué)成分主要以醛酮類化合物為主，為進(jìn)一步開發(fā)和利用石榴花資源提供了理論依據(jù)。而β-葡萄糖苷酶則抑制了石榴花中一些香精類成分的釋放，這證明了β-葡萄糖苷酶的加入，致使一些香精類成分含量有所減少，其只能增加石榴花中的某些特定成分，如L-檸檬烯，而不能使全部香精成分的相對含量增加，故其對石榴花的增香作用并不明顯。