羧基化多壁碳納米管單一及其與鎘復合處理對水稻幼苗葉片毒性效應的研究

劉 玲， 楊俊文， 陳 成， 戴慧芳， 許婷婷， 孟 壯， 方炎明

(1. 淮南師范學院生物工程學院， 安徽 淮南 232038； 2. 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院， 江蘇 南京 210037)

碳納米管(CNTs)是一種纖維化的納米材料，因其具有自收縮、抗裂、增韌和半導體等特性被廣泛應用于工業(yè)、陶瓷業(yè)和信息工程等領域[1-3]。由于對CNTs持續(xù)的開發(fā)、生產(chǎn)和應用，CNTs不可避免地釋放到環(huán)境中[4-5]。植物是生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，在從土壤或水體吸收營養(yǎng)的同時伴隨著對其中CNTs的吸附，植物對CNTs具有潛在的累積效應，被認為是CNTs進入生物循環(huán)的重要途徑[6-7]。因此，研究CNTs對植物生長的毒性效應及其在環(huán)境中的遷移和轉化至關重要。CNTs分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)，其中，MWCNTs具有較強的抗壓抗折[8-9]和導電導熱能力[10-11]，且成本較低，易制取，用途廣泛[12]。MWCNTs的表面功能化能改變材料本身的化學和物理學特性，使其穩(wěn)定性和生物相容性增加，從而增強材料本身的工業(yè)化應用潛力[13]。羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)作為MWCNTs表面功能化的典型代表，其分散性和親水性更佳，市場應用前景更廣。

近年來，MWCNTs和MWCNTs-COOH的生態(tài)安全性受到人們越來越多的關注。研究結果表明：MWCNTs可降低微生物活力[14]，引起小鼠骨髓細胞和人體淋巴細胞染色體畸變和DNA異常，影響肝臟代謝功能，對哺乳動物具有潛在毒性[15-17]。高濃度MWCNTs不僅抑制藻細胞增殖，降低葉綠素a含量和抗氧化酶活性[18-19]，還對作物根和葉的形態(tài)產(chǎn)生不利影響[20]。另外，MWCNTs團聚物對植物細胞也存在脅迫，干擾擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕T87懸浮細胞的干質量、通透性和超氧化物歧化酶(SOD)活性等[21]。MWCNTs-COOH進入植物體內(nèi)，致使葉片氧化損傷加劇，植物亞細胞結構被破壞[22]。

MWCNTs-COOH具有較大的比表面積且易分散在水體中，其吸附性能得到極大發(fā)揮，易成為有機和重金屬污染物的載體，并對其毒性產(chǎn)生影響[23-24]。已有研究結果證明：MWCNTs-COOH具有吸附重金屬的能力，并能夠促進重金屬離子向植物根和葉細胞內(nèi)部滲透[22]。在MWCNTs-COOH和重金屬復合污染的環(huán)境介質中，二者間不可避免地會發(fā)生相互作用，進而干擾重金屬的環(huán)境行為和對生態(tài)系統(tǒng)的毒性效應[25]。目前，關于單一MWCNTs-COOH或鎘(Cd)對植物生長影響的研究很多，而關于MWCNTs-COOH與Cd復合作用下對植物生長影響的研究較少，MWCNTs-COOH與Cd復合作用對植物的毒性作用機制尚不明確。為此，本研究以水稻(OryzasativaLinn.)品種‘Y兩優(yōu)900’(‘Y Liangyou 900’)幼苗為實驗對象，選取Cd作為典型重金屬，研究水稻幼苗在MWCNTs-COOH單一及其與Cd復合處理下葉片生理特性的變化，以期為早期診斷和科學評價MWCNTs-COOH與Cd復合污染的生態(tài)風險提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)及鎘(Cd)的母液配制 MWCNTs-COOH(外徑8～15 nm，長0.5～2.0 μm，純度大于95%)購自中國科學院成都有機化學有限公司。取500 mg MWCNTs-COOH，加入適量的去離子水，使用SCIENTZ JY92-Ⅱ超聲波破碎儀(河北慧采科技開發(fā)有限公司)于650 W超聲振蕩150次，每次振蕩15 s、間歇10 s，最后定容至500 mL，制成1 mg·mL-1MWCNTs-COOH母液，備用，使用時進行稀釋。

供試Cd源為氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)。取1.140 g氯化鎘，加入適量去離子水溶解，然后定容至500 mL，制成10 μmol·mL-1Cd母液，備用，使用時進行稀釋。

1.1.2 水稻幼苗培養(yǎng) 將籽粒飽滿、大小基本一致的水稻品種‘Y兩優(yōu)900’種子(湖南袁創(chuàng)超級稻技術有限公司)進行浸種催芽(0.1 mol·L-1HNO3溶液浸泡16～24 h，去離子水清洗后，于30 ℃水浴中浸泡2 d，每天換水2次)，種子露白后，放在鋪有濕潤紗布的白瓷盤中，于黑暗條件、30 ℃人工氣候箱中培育。待幼芽長至約5 mm時，挑選芽勢相近的萌發(fā)種子懸浮培養(yǎng)于1/4 Hoagland營養(yǎng)液中(漂浮板固定)，于光照度3 000 lx、光照時間16 h·d-1和空氣相對濕度70%條件下進行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液。待第3枚真葉長出，株高和直徑分別達7.5 cm和0.5 cm 左右(種子萌發(fā)21 d)，移植到培養(yǎng)盒(長320 mm、寬240 mm、高120 mm)中進行處理，每盒48株幼苗。

1.2 方法

1.2.1 處理方法 設置MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復合處理，共10個處理：CK1不添加MWCNTs-COOH，即0 mg·L-1MWCNTs-COOH；S1、S2、S3和S4單一處理分別添加1.5、3、6和12 mg·L-1MWCNTs-COOH；CK2添加10 μmol·L-1Cd；C1、C2、C3和C4復合處理分別添加1.5、3、6和12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd，基礎培養(yǎng)液為Hoagland營養(yǎng)液，pH 5.3至pH 5.5。每7 d更換1次處理液。21 d后，測定和觀察葉片相關指標。每個處理種植3個培養(yǎng)盒，即為3次重復。

SOD活性的測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法[27]218-219并略有改動。稱取葉片0.5 g，加入5倍于樣品質量的50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.8)冰浴研磨，經(jīng)10 000 r·min-1離心20 min，上清液為粗酶提取液。取粗酶提取液0.1 mL，加入50 mmol·L-1磷酸緩沖液3.5 mL、130 mmol·L-1混合型甲硫氨酸0.5 mL、750 μmol·L-1NBT 0.5 mL、100 μmol·L-1EDTA-Na20.5 mL、蒸餾水0.4 mL和20 μmol·L-1核黃素0.5 mL(最后加入)，在光照度2 000 lx條件下照射12 min后立即測定OD560，計算SOD活性。

各處理每個指標均重復測定3次。

1.2.3 葉片H2O2定位 葉片H2O2定位參考王晨芳[28]的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色法并略有改動。于每個培養(yǎng)盒中隨機選取3株水稻幼苗的倒三葉置于錐形瓶中，加1 mg·mL-1DAB染液浸沒，于黑暗條件、120 r·min-1搖床振蕩過夜后，光照度2 000 lx下照射至所有葉片出現(xiàn)褐色斑點。然后將水稻葉片從DAB染液中取出，加脫色液〔V(無水乙醇)∶V(甘油)∶V(去離子水)=15∶1∶4〕后，于80 ℃水浴脫色30 min，將脫色的葉片抽真空后平鋪于濾紙上，對比不同處理和對照間各葉片顏色的差異并拍照。每處理3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，利用單因素方差分析進行差異顯著性檢驗。

2 結果和分析

2.1 MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復合處理對水稻幼苗葉片生理指標的影響

MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復合處理對水稻幼苗葉片生理指標的影響見表1。

2.1.1 對葉綠素含量的影響 由表1可見：隨著MWCNTs-COOH質量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片葉綠素含量呈逐漸降低的趨勢，但與0 mg·L-1MWCNTs-COOH(CK1)組間均無顯著差異；MWCNTs-COOH-Cd復合處理組水稻幼苗葉片葉綠素含量的變化趨勢與MWCNTs-COOH單一處理組相同，其中，1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C1)和3 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C2)復合處理組的葉綠素含量均高于0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(CK2)組，12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C4)復合處理組的葉綠素含量較CK2組顯著(P<0.05)降低。同一質量濃度MWCNTs-COOH-Cd復合處理組的葉綠素含量均低于MWCNTs-COOH單一處理組，其中，C4復合處理組與12 mg·L-1MWCNTs-COOH(S4)單一處理組間差異顯著。

2.1.2 對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響 由表1還可見：隨著MWCNTs-COOH質量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片SOD活性呈先升高后降低的趨勢，4個MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片SOD活性均高于CK1組，其中，6 mg·L-1MWCNTs-COOH(S3)單一處理組的SOD活性(24.70 U·mg-1)最高；MWCNTs-COOH-Cd復合處理組水稻幼苗葉片SOD活性呈逐漸降低的趨勢，其中，C1復合處理組的SOD活性(21.59 U·mg-1)最高。同一質量濃度MWCNTs-COOH-Cd復合處理組的SOD活性均低于MWCNTs-COOH單一處理組，其中，C2、6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C3)和C4復合處理組分別與對應的單一處理組間差異顯著。

2.1.3 對過氧化物酶(POD)活性的影響 由表1還可見：隨著MWCNTs-COOH質量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片POD活性呈先升高后降低的趨勢，其中，3 mg·L-1MWCNTs-COOH(S2)和S3單一處理組的POD活性較高，與CK1組間差異顯著，之后POD活性顯著降低；MWCNTs-COOH-Cd復合處理組水稻幼苗葉片POD活性呈“降低—顯著升高—降低”的趨勢。同一質量濃度MWCNTs-COOH-Cd復合處理組與MWCNTs-COOH單一處理組間水稻幼苗葉片POD活性均存在顯著差異。

2.1.4 對丙二醛(MDA)含量的影響 由表1還可見：隨著MWCNTs-COOH質量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片MDA含量呈逐漸升高的趨勢，其中，S3和S4單一處理組的MDA含量較高，分別較CK1組顯著升高了17.1%和23.4%；MWCNTs-COOH-Cd復合處理組水稻幼苗葉片MDA含量的變化趨勢與MWCNTs-COOH單一處理組相同，但不同質量濃度MWCNTs-COOH-Cd復合處理組間的MDA含量無顯著差異。同一質量濃度MWCNTs-COOH-Cd復合處理組的MDA含量均高于MWCNTs-COOH單一處理組，但均無顯著差異。

2.2 MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復合處理對水稻幼苗葉片H2O2定位的影響

MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復合處理對水稻幼苗葉片H2O2定位的影響見圖1。由圖1可見：1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH單一處理組與1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd復合處理組間水稻幼苗葉片褐色斑點面積差異不大；與0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd組相比，6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd和12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd復合處理組葉片褐色斑點面積增大、顏色加深。

CK1： 0 mg·L-1MWCNTs-COOH； S1： 1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH； S2： 3 mg·L-1MWCNTs-COOH； S3： 6 mg·L-1MWCNTs-COOH； S4： 12 mg·L-1MWCNTs-COOH； CK2： 0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C1： 1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C2： 3 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C3： 6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C4： 12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd.

圖1 MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復合處理對水稻幼苗葉片H2O2定位的影響

Fig. 1 Effect of single MWCNTs-COOH and combined MWCNTs-COOH-Cd treatments on H2O2localization of leaves ofOryzasativaLinn. seedlings

3 討 論

葉綠素含量是反映植物光合作用水平的基本指標[29]。楊祥宇[30]的研究結果表明：1～50 mg·L-1納米二氧化鈦能夠提高黃瓜(CucumissativusLinn.)和蘆葦〔Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.〕等植物的光合色素含量。本研究中，1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH(S1)單一處理組水稻幼苗葉片葉綠素含量最高，而12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C4)復合處理組的葉綠素含量最低，說明低質量濃度MWCNTs-COOH可能對水稻生長具有一定的促進作用，高質量濃度MWCNTs-COOH和重金屬Cd共同作用則會對水稻造成毒害作用，使葉綠素合成受抑制，進而導致葉綠素含量下降。MWCNTs-COOH單一及其與Cd復合處理均較納米二氧化鈦對植物的毒性更強，這可能與納米材料和植物種類有關[31]，但具體原因還有待深入研究。

綜上所述，高質量濃度MWCNTs-COOH單一及其與Cd復合處理對水稻幼苗葉片生理和生長影響顯著，主要表現(xiàn)為SOD和POD活性降低、MDA含量升高、葉綠素降解及葉片受損傷等，因此，要降低MWCNTs-COOH與Cd復合作用帶來的生態(tài)風險。