螺旋藻激酶抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷與一氧化氮的相關(guān)性

楊曉梅 陳萌 龐輝 趙杰 王慧杰 韋嬌

(廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021)

心腦血管疾病的致病因素是血管損傷和血栓形成，它們的起始環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而氧化應(yīng)激、慢性炎癥被公認(rèn)是血管內(nèi)皮損傷發(fā)生發(fā)展的重要因素，因此，尋找抗氧化、抗炎等綜合療效高的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)藥物，對(duì)預(yù)防心腦血管疾病有重要的臨床價(jià)值〔1〕。一氧化氮(NO)是在體內(nèi)由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生的產(chǎn)物，它能清除氧自由基，是抗氧化的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)因素，它的含量變化與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)〔2〕。螺旋藻(Spirulina) 為原核生物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，發(fā)酵酶化后獲得一種蛋白激酶，稱為螺旋藻激酶(SPK)。SPK具有防止血液凝固和溶解血栓的作用，它可以預(yù)防血栓性疾病，并且其作用與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能有關(guān)。SPK可降低氧化應(yīng)激時(shí)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔2～5〕。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)過(guò)氧化氫(H2O2)建立氧化損傷模型，觀察SPK對(duì)細(xì)胞形態(tài)和活力、三磷酸腺苷(ATP)、NO和NOS活性的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試藥試劑與儀器 螺旋藻發(fā)酵粉(北海市康福保健品有限公司)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，美國(guó)Scien Cell公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；Trypsin 1∶250(美國(guó)Shellab公司)；ATP、NO、NOS測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶標(biāo)分析儀(Thermo Labsystems公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLAB 公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)；Integral 10 純水儀(美國(guó)Millipore 公司)；臺(tái)式低溫離心機(jī)(湖南長(zhǎng)沙平凡有限公司)。

1.2方法

1.2.1藥物的制備 SPK的提取采用水提法：將螺旋藻發(fā)酵粉水中浸泡，然后低溫離心后收集上清液，使用硫酸銨進(jìn)行分級(jí)鹽析后收集沉淀，經(jīng)透析，凍干，凝膠層析后，凍干保存?zhèn)溆?，提取得到的SPK比活為2 631 U/mg〔2〕。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞復(fù)蘇后，生長(zhǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)密度達(dá)到90%時(shí)開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳3～4代，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 將傳3～4代 HUVEC細(xì)胞懸液以5×104/孔接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁4 h 后，設(shè)置正常組(實(shí)驗(yàn)中不加任何物質(zhì)干擾，完全培養(yǎng)基中正常培養(yǎng))；模型組(在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.2 mmol/L H2O2進(jìn)行處理)：陽(yáng)性對(duì)照組〔在細(xì)胞培養(yǎng)液中用10 mg/L維生素(Vit)E預(yù)處理后，然后加0.2 mmol/L H2O2共培養(yǎng)〕；SPK低、中、高劑量組(在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別用1、2、3 g/L SPK進(jìn)行預(yù)處理，然后再加0.2 mmol/L H2O2繼續(xù)共培養(yǎng)),分別于給藥后24 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20℃冷凍保存待測(cè)。

1.2.4SPK對(duì)HUVEC細(xì)胞活性的影響 HUVEC細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，正常組和模型組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組和SPK低、中、高劑量組加入所需藥物預(yù)孵育12 h；孵育完成后在模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和SPK低、中、高劑量組加入濃度為0.2 mmol/L的H2O2進(jìn)行損傷，時(shí)間為4 h，正常組不做藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml) ，繼續(xù)孵育4 h，去上清加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，水平搖床振蕩，酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)讀取各孔吸光度(OD)值。

1.2.5形態(tài)學(xué)觀察 將HUVEC細(xì)胞按4×105個(gè)接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量的測(cè)定 取細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μl，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管，按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。在波長(zhǎng)550 nm 0.5 cm光徑，測(cè)各管OD值。按說(shuō)明書(shū)計(jì)算公式即可得NO含量。

1.2.7細(xì)胞培養(yǎng)液中NOS活力的測(cè)定 取100 μl收集的上清液，檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)，顯色后酶標(biāo)儀在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，根據(jù)OD計(jì)算NOS活力。

1.2.8ATP含量測(cè)定 按1.2.4方法培養(yǎng)后,收集細(xì)胞及培養(yǎng)液進(jìn)行超聲破碎處理獲得細(xì)胞破裂懸液，利用肌酸激酶催化ATP和肌酸生成磷酸肌酸的原理，用磷鉬酸比色法對(duì)細(xì)胞破碎懸液進(jìn)行檢測(cè)。用雙蒸水調(diào)零，在636 nm波長(zhǎng)，0.5 cm光徑下，測(cè)定樣本OD值，按照明書(shū)公式即可計(jì)算得出ATP含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、Games-Howell法、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SPK對(duì)H2O2損傷HUVEC活性的影響 模型組細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞活性下降明顯(0.401±0.043)，與正常組相比有顯著性差異(0.867±0.033，P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞損傷減小(0.547±0.053)，較模型組活性有顯升高(P<0.05)；SPK 低、中、高劑量組細(xì)胞活性明顯上升(0.482±0.028、0.531±0.064、0.579±0.074)，與模型組相比，SPK中、高劑量組有顯著差異(P<0.05) ，且呈劑量依賴性加強(qiáng)。

2.2SPK對(duì)H2O2損傷HUVEC形態(tài)的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞間縫隙變大，數(shù)量有所減少，細(xì)胞變形，漂浮(見(jiàn)圖1模型組箭頭)；而陽(yáng)性對(duì)照組，SPK高、中、低劑量組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞間連接緊密，呈“鋪路石”狀排列(見(jiàn)圖1 SPK中劑量組箭頭)。

圖1 SPK對(duì)H2O2刺激下HUVEC形態(tài)學(xué)的影響(×100)

2.3SPK對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中ATP含量的影響 與正常組相比，模型組的ATP含量明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組含量明顯上升(P<0.05)， SPK低、中、高劑量組的ATP含量均明顯上升(P<0.05)，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)表1。

2.4SPK對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、NOS含量的影響 與正常組相比較，模型組內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比較，陽(yáng)性對(duì)照組和SPK藥物組均能使NO分泌量顯著增加(P<0.05)。與正常組比較模型組NOS顯著下降，SPK高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組NOS顯著高于模型組(P<0.05)，SPK低、中劑量組NOS有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組ATP、NO、NOS含量比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

3 討 論

在引起心腦血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因素中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起血管壁增生、硬化是一個(gè)重要的因素，而NO代謝紊亂、氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激時(shí)出現(xiàn)功能失調(diào)，導(dǎo)致血小板黏附、聚集，炎性細(xì)胞活化產(chǎn)生炎癥因子，而多種炎癥因子又加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷〔1，2〕。NO是在體內(nèi)由NOS催化生成的內(nèi)源性血管舒張因子，它具有抗血小板黏附、抗氧化作用、抗炎性反應(yīng)、抗平滑肌細(xì)胞增殖等作用。NO能清除氧自由基，還能抑制血小板黏附和聚集，阻止內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，從而減少炎性細(xì)胞與血管壁的黏附，防止血管中膜增生。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙時(shí)，伴隨NO生物活性降低，它含量的變化與心腦血管疾病的發(fā)展有密切的關(guān)系〔6～9〕。NOS是在體內(nèi)以L-精氨酸為底物催化生成NO的酶，在正常情況下，NO主要由存在于內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮型NOS合成。因此，內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)影響NOS的活性，繼而影響NO的含量和生物學(xué)作用。有實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)NOS活性增高，引起NO含量增加時(shí)，可對(duì)抗氧自由基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷〔10〕。

線粒體是一個(gè)敏感多變的細(xì)胞器，其主要作用是能源物質(zhì)的氧化和能量轉(zhuǎn)換，ATP是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的基本載體，ATP 水平提示線粒體功能情況，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)會(huì)引起線粒體的功能障礙，這可能是血管損傷引起心腦血管疾病中的中間機(jī)制〔1，8〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的ATP水平，了解線粒體的損傷程度及功能情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷時(shí)，ATP水平下降， SPK對(duì)線粒體有一定的保護(hù)作用，可減輕過(guò)氧化物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞H2O2造成的內(nèi)皮細(xì)胞氧化性損傷，可使內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，而經(jīng)過(guò)SPK預(yù)干預(yù)后，減弱了H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷作用，使內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，ATP水平增加，同時(shí)使細(xì)胞培養(yǎng)液的NO含量和NOS活性明顯增加，可見(jiàn)SPK的保護(hù)功能可能通過(guò)增加NO含量來(lái)實(shí)現(xiàn)預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展。