高尿酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其對血管新生的影響

羅雪蘭 滕紅麗 覃裕旺 張文宇 唐華民 呂冬寧 楊鵬 楊國勛 歐和生

(1廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院科技部，廣西 南寧 530201；2中鐵十二局集團(tuán)有限公司中心醫(yī)院藥械科)

高尿酸血癥是代謝綜合征的一種表現(xiàn)。高濃度尿酸可導(dǎo)致高尿酸血癥，并引起痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)結(jié)石及關(guān)節(jié)畸形等，常累及腎臟，此外，還被認(rèn)為是內(nèi)皮損傷的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥不僅會導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)生和腎結(jié)石的沉積，更是獨立于高血壓、糖尿病、肥胖等危險因素以外的誘發(fā)心血管疾病的重要獨立危險因素〔1～3〕。

血管新生主要有兩個重要反應(yīng)，一是新生血管形成，二是血管生成，二者均為內(nèi)皮細(xì)胞最重要的特征，為器官的正常生理功能提供了基礎(chǔ)。血管生成受損是心血管疾病的一個重要原因。目前，臨床上將男性血尿酸>420 μmol/L，女性>360 μmol/L確定為高尿酸血癥。有研究顯示〔4,5〕，女性的血尿酸水平每增加1 μmol/L，其高血壓的患病風(fēng)險將增加0.40%；同時，血尿酸水平四分位數(shù)最高的女性，其高血壓的患病風(fēng)險是血尿酸水平四分位數(shù)最低者的2.015 倍；而罹患高尿酸血癥的女性，其高血壓的患病風(fēng)險是未患病者的1.563倍。另有研究表明，罹患高尿酸血癥患者心血管疾病的死亡風(fēng)險會增加〔6〕。然而目前高尿酸血癥對心血管系統(tǒng)損傷的機制研究仍處于初步階段，高濃度尿酸是否影響血管生成及這種影響的潛在機制尚不清楚。本研究旨在探討高尿酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)及其血管新生的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購自武漢Procell公司；定量PCR試劑盒由大連TaKaRa公司提供；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑購自北京Solarbio科技有限公司；Ⅰ抗eNOS兔源多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；GAPDH兔抗購自PeproTech公司；尿酸鈉鹽(CAS：1198-77-2)購自Sigma公司；Trizol試劑(15596-026)購自美國Invitrogen公司；澳洲胎牛血清(FBS，10099-141)、胰蛋白酶消化液、1640 細(xì)胞培養(yǎng)基和人工基底膜(基質(zhì)膠)均購自美國Gibco公司；一氧化氮(NO)測試盒(貨號A012)由南京建成生物工程研究所供給。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與高尿酸溶液的配置 HUVECs用含10% FBS、青霉素(1×105U/L)/鏈霉素(100 mg/L)的Gibco RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。將尿酸粉末溶于1 mol/L NaOH溶液中，并配置成40 mmol/L尿酸鈉溶液，然后加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至600 μmol/L，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4。將上述尿酸鈉溶液加入HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實驗。根據(jù)實驗所需，細(xì)胞分為對照組和高尿酸組。

1.3RT-PCR檢測各組細(xì)胞eNOS mRNA 的表達(dá) HUVECs在600 μmol/L濃度分別培養(yǎng)24、48 h，按Invitrogen的TRIzol 提取試劑盒步驟提取各組細(xì)胞總RNA。應(yīng)用Primer5.0 軟件，根據(jù)eNOS基因序列，合成人eNOS引物序列，其中上游引物序列為5′-AGGAACCTGTGTGACCCTCA-3′，下游引物序列為5′-CGAGGTGGTCCGGGTATCC-3′，GAPDH上游引物序列為5′-AACTTTGGCATTGTGG-AAGG-3′，下游引物序列為5′-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′，GAPDH作為內(nèi)參。分別取各實驗組細(xì)胞RNA 1 μg根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逐步加入各反應(yīng)物，最終逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)處理5 min，30個循環(huán)： 94℃ 30 s、56℃退火 1 min、72 ℃延長1 min。最后取5 μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.4Western印跡檢測各組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá) HUVECs在600 μmol/L高尿酸條件下分別培養(yǎng)24、48 h，待細(xì)胞完全融合后，用細(xì)胞裂解液裂解，于低溫高速離心機4℃，經(jīng)12 000 r/min離心15 min，隨后收集上清液，二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白含量，取平均值。分別取各組細(xì)胞蛋白60 μg在8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后加入 Ⅰ 抗eNOS抗體并在4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜10 min/次，共3次。加入羊抗兔Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)，37℃ 孵育1 h，TBST 緩沖液沖洗，仍為10 min/次，共3 次。使用美國 LI-COR 公司的 Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析。

1.5硝酸還原法檢測各組HUVECs的NO含量 分別收集高尿酸條件培養(yǎng)24、48 h的各組細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液，應(yīng)用細(xì)胞震碎儀破裂細(xì)胞，于4℃條件下，經(jīng)12 000 r/min離心15 min，隨后收集上清液。根據(jù)硝酸還原檢測法說明書的步驟逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，取標(biāo)準(zhǔn)品與各組樣品各100 μl，接著按說明書要求逐步加入各種試劑。最后將上述液體以150 μl/孔注入 96孔板，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定儀測定550 nm處各組液體的OD值。根據(jù)說明書公式計算NO含量。實驗重復(fù)3遍。

1.6高尿酸對HUVECs成管能力的影響 取出經(jīng)4℃冰箱過夜解凍的基質(zhì)膠，在冰上將20 μl/孔平鋪于96孔板中，接著將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)1 h。各組細(xì)胞消化后用無血清培養(yǎng)基重懸，同時高尿酸組用600 μmol/L尿酸鈉溶液處理，并以每孔1×104個分別接種于鋪好的基質(zhì)膠上，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48 h后鏡下觀察小管的形成情況(隨機取5個視野)。

1.7高尿酸對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管新生的影響 選取已孵育7 d的雞胚，用小鉆在雞胚胚頭上方鉆開一1.0～2.0 mm的小孔并穿透氣室殼膜，用75%酒精棉球擦拭消毒小孔周圍。用注射針頭在卵殼膜上輕輕劃出一小孔，小心暴露CAM，無菌膠帶封閉窗口后，置于孵化箱孵化。隔日取出雞胚，剪取0.5 cm × 0.5 cm的無菌明膠海綿載體置于CAM上血管較少的區(qū)域，使用移液槍分別滴加50 μl對照組和高尿酸組細(xì)胞培養(yǎng)液，無菌膠帶封閉雞胚窗口后，放回雞胚孵化箱中繼續(xù)孵化。72 h后取出雞胚，用甲醇丙酮1∶1混合液室溫固定CAM 15 min。待CAM上的血管內(nèi)血液凝固，剪下CAM，翻轉(zhuǎn)貼于濾紙上并拍照。使用Image J軟件處理圖像，計算所選區(qū)域血管面積/CAM面積的百分比率。

1.8MTT法檢測HUVECs增殖 分別取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96 孔板中，每孔1×104個細(xì)胞，其中高尿酸組加入600 μmol/L尿酸鈉溶液，置于37℃、5% CO2飽和濕度恒溫箱中。待細(xì)胞融合率達(dá)50%，更換為無血清RPMI1640培養(yǎng)基和含600 μmol/L尿酸鈉溶液的無血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在24、48、72 h加入MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定570 nm波長下每孔OD值，實驗重復(fù)3遍。

1.9細(xì)胞劃痕試驗檢測HUVECs的遷移能力 分別取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔 1×104個接種到 96 孔板，高尿酸組加入600 μmol/L尿酸鈉溶液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待各孔細(xì)胞培養(yǎng)至基本融合，用10 μl槍頭在每個孔的底部劃“一”，并用無菌PBS沖洗，盡量洗去劃落的細(xì)胞及碎片，然后分別加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基和含600 μmol/L尿酸鈉溶液的無血清RPMI1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)0、12、24 h，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移愈合情況。實驗重復(fù)3 次。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1高尿酸對細(xì)胞eNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組(1.01±0.02)相比，高尿酸培養(yǎng)24、48 h后，eNOS mRNA 轉(zhuǎn)錄水平(0.77±0.05、0.52±0.03)分別降低23.76%、48.51%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(1.00±0.02)比較，培養(yǎng)24 h、48 h后，高尿酸組eNOS蛋白表達(dá)量(0.81±0.05、0.45±0.02)分別減少19.00%、55.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，見圖1。

2.2高尿酸對HUVECs代謝產(chǎn)物NO含量的影響 高尿酸培養(yǎng)細(xì)胞24、48 h后，NO濃度〔(30.77±3.99)、(39.56±4.07)μmol/L〕較對照組〔(45.92±4.21)、(72.05±6.24)μmol/L〕降低了 32.99%、45.09%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 高尿酸對HUVECs eNOS蛋白表達(dá)的影響

2.3高尿酸對HUVECs成管能力的影響 與對照組相比，高尿酸組HUVECs在高尿酸條件下培養(yǎng)24 h，尚能形成管腔樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，細(xì)胞則有聚集傾向，但沒有形成完整的管腔樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。說明高尿酸抑制HUVECs的管腔形成，見圖2。

圖2 高尿酸對HUVECs管腔形成能力的影響(×200)

2.4高尿酸對CAM血管新生的影響 對照組CAM的大血管和微血管分支呈葉脈狀均勻分布，可見放射狀密集生長的血管網(wǎng)。與對照組相比，高尿酸組大血管直徑明顯變窄，二級血管與微血管數(shù)量明顯減少且稀疏，見圖3。與對照組〔(55.72±3.16)%〕相比，高尿酸組血管新生面積比率〔(27.98±1.95)%〕降低49.78%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 高尿酸對CAM血管新生的影響(×50)

2.5高尿酸對HUVECs增殖和遷移的影響 與對照組比較，高尿酸濃度環(huán)境下，HUVECs的增殖明顯受抑制(P<0.05)，見表1。

表1 兩組相對增殖抑制率比較

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

劃“一”操作24、48 h后，與對照組〔(56.29±3.16)%、(88.57±7.23)%〕相比，高尿酸組細(xì)胞愈合率〔(38.96±4.77)%、(54.29±4.08)%〕下降30.79%、38.70%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，提示高尿酸條件下，HUVECs的遷移受到一定抑制，見圖4。

圖4 高尿酸對HUVECs遷移的影響(×100)

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高尿酸顯著抑制eNOS基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，顯著抑制HUVECs的成管能力、CAM的血管生成及HUVECs的增殖與遷移。高尿酸對HUVECs血管新生的抑制作用可能與其對eNOS基因的表達(dá)相關(guān)。

目前，血尿酸的程度與代謝綜合征、糖尿病、原發(fā)性高血壓、冠心病及慢性腎臟病(CKD)等多種疾病的預(yù)后呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系〔7～9〕。據(jù)報道，高尿酸血癥引起的病理生理變化并不完全取決于尿酸晶體的沉積，實際上，它對引起的細(xì)胞損傷起關(guān)鍵作用〔10〕。以往研究表明，在600 μmol/L尿酸存在下培養(yǎng)的HUVECs與正常條件下培養(yǎng)的反應(yīng)有所不同，但這種濃度的尿酸不會影響正常HUVECs的生存能力〔11,12〕。在高尿酸條件下，許多細(xì)胞基因的表達(dá)發(fā)生改變，如Toll樣受體(TLR)4和核因子(NF)-κB〔11〕及eNOS〔12〕，這些基因的改變很可能參與高尿酸血癥及痛風(fēng)的病理生理過程。

eNOS作為NO生成的關(guān)鍵酶，具有組織特異性，且廣泛存在于心血管系統(tǒng)中，其表達(dá)異常是心血管疾病的重要危險因素〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)〔14〕，野百合堿(Monocrotaline)可誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮功能障礙與PA重構(gòu)，引起肺動脈高壓，而eNOS 基因的表達(dá)減少及活性下降在其中起了關(guān)鍵性作用。eNOS基因敲除小鼠表現(xiàn)為全身性高血壓，而單次注射裸露eNOS質(zhì)粒DNA后SHR大鼠血壓降低〔15,16〕。另外，研究表明〔17〕，內(nèi)皮源性NO生物利用度降低，體內(nèi) NO 水平下降，同時下降的嚴(yán)重程度與血壓的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。已有研究表明，在高濃度尿酸的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS表達(dá)下降，NO釋放會減少〔18〕。本研究結(jié)果均顯示，高尿酸培養(yǎng)24 h和48 h后，eNOS的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)均下降；NO的產(chǎn)生和釋放也減少。另外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，eNOS參與細(xì)胞的血管生成，如對干細(xì)胞的血管生成有促進(jìn)作用〔19〕。

血管形成是血管新生的重要反應(yīng)，涉及多種血管內(nèi)細(xì)胞和血管內(nèi)調(diào)節(jié)因子的共同調(diào)控。由于血管形成反應(yīng)與組織缺血區(qū)的毛細(xì)血管增殖密切相關(guān)，并可改善局部組織缺氧，成為了心血管疾病的研究熱點。缺血性心血管疾病仍是世界上發(fā)病率和死亡率的主要原因之一，促血管生成治療是治療缺血性心血管疾病一種可行的方法。研究發(fā)現(xiàn)，EfoinB2/ EphB4通路在血管生成中的作用機制，可能有助于開發(fā)新的缺血性心血管疾病治療方法〔20〕。JAZF1過表達(dá)可激活心肌缺血再灌注大鼠的Akt信號通路，從而促進(jìn)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成〔21〕。然而，血管生成受體內(nèi)外多種因素的影響，如氧化應(yīng)激、高糖及高尿酸等〔22～24〕。高尿酸刺激下，miR-92a的表達(dá)下調(diào)， Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF)2表達(dá)增加，隨后抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A的表達(dá)，從而抑制HUVECs的管腔形成。前期研究顯示，eNOS基因的表達(dá)下調(diào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移能力和成管能力受到抑制〔25,26〕，因此，高尿酸刺激有可能通過減少eNOS的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的成管及CAM的新生血管，然而所述過程的相關(guān)機制是否仍有其他影響因素尚未得知，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，在高尿酸(600 μmol/L)條件的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS基因表達(dá)下降，NO的生成與釋放減少，對eNOS基因的表達(dá)調(diào)控，可能為今后高尿酸血癥的防治提供實驗依據(jù)，eNOS可能是高尿酸血癥治療的靶基因之一。